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摘要
摘要
菊花[Dendronthema ×grandiflora (Ramat.) Kitam.] 是我国十大传统名花和世界
四大鲜切花之一,在传统育种方面取得了巨大成果。近年来,菊花的转基因育种又成
为菊花研究的热点,并已取得了初步成果。菊花的转基因研究所用的启动子多为花椰
菜花叶病毒(CaMV)的 35S 启动子,该启动子为组成型启动子,不能调控其表达的
时间、部位和强度,由于来自低等生物,也存在表达水平低的问题。组织特异性启动
子的应用,虽然可以控制表达的部位,表达水平也大为提高,但仍不能调控其表达的
时间和强度。诱导型启动子的应用则有希望解决这两个方面的问题。利用诱导型启动
子与菊花观赏性状(如花期和花色等)相关的基因相融合,研究基因的表达规律,进
而进行转基因育种,达到能人为控制花期、花色等观赏性状的目的,具有重要的理论
和实践意义。甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因是植物
体内甜菜碱合成途径中的重要基因,该基因的表达受干旱、盐、脱落酸等因素的诱导。
而盐诱导是最容易施行的诱导措施。本文在分析了菊科植物 BADH 基因资源的基础
上,从耐盐性较强的菊花近缘植物甘菊[Dendranthema lavandulifolium (Fisch. ex
Trautv.) Makino]中克隆了 4 个 BADH 基因的启动子序列,并初步鉴定各序列均具有
启动子功能,为进一步鉴定该启动子的表达机理,进而驱动与菊花观赏性状相关的基
因进行转基因育种奠定了基础。主要研究结果如下:
24 种耐旱、耐盐性较强的菊科野生植物,还收
集了两个栽培种及两个菊花栽培品种,利用 PCR-Southern 的方法检测了上述植物中
的 BADH 基因,从其中 20 个种(包括品种)中检测到该基因。并通过测序和序列分
析,获得了菊科植物中 BADH 基因的基本信息,为进一步研究菊科植物中的 BADH
基因及其启动子奠定了基础。
RT-PCR、PCR-RACE 技术从甘菊中克隆了 BADH 基因的两个全长 cDNA
序列,分别命名为 DlBADH1 和 DlBADH2(GenBank 登录号分别为 DQ011151 和
DQ011152),序列长分别为 1 821 bp 和 1 918 bp。由其核苷酸序列推导的氨基酸序
列中,均含有醛脱氢酶高度保守的十肽(VTLELGGKSP)和与酶功能相关的半胱氨
酸残基(C)。两序列与已发表的其它植物 BADH 基因的氨基酸序列的同源性在 64%
以上。半定量分析表明,甘菊 BADH 基因的表达受盐诱导。
I
甘菊 BADH 基因启动子的克隆及瞬时表达分析
5′RACE 策略,利用锚定 PCR 步移的方法克隆了甘菊 BADH 基因的 4
个启动子序列,分别命名为 DBP11、DBP12、DBP21 和 DBP22(GenBank 登录号分
别为 DQ497620-DQ497623),序列长度分别为 1 230 bp、1 249 bp、1 273 bp 和 574 bp。
4 个启动子序列对应区域的同源性在 89%以上。其中 DBP12 和 DBP21 分別是
DlBADH1 和 DlBADH2 的启动子序列,DBP11 和 DBP22 为甘菊 BADH 基因家族中其
它成员的启动子序列。序列分析表明,上述启动子序列中均含有多处与水分胁迫和脱
落酸诱导相关的顺式作用元件的同源序列。
的基础上,用所克隆的 4 个甘菊 BADH 基因启
动子序列分别置换驱动其报告基因表达的 35S 启动子,建立了新的植物表达