文档介绍：第八章体外分析技术体外分析技术是一组超微量体外分析技术的总称,它是利用某种特异性结合剂与被测物和标记物进行结合反应,从而对极微量物质进行定量分析的分析技术。1960年Berson和Yalow首次应用放射免疫分析法(RIA)测定胰岛素,开创了生物活性物质微量测定的新时代,是微量分析方法学上的一大突破。本章主要以RIA为例介绍这类方法的基本原理及方法特点。嗅乖恤询认尾赫钨蝴揪炙尹希收然勃蔓翔爹蝴需港旨泪辗纯韧崖泻侮负瓶标记免疫分析标记免疫分析第一节放射免疫分析一、基本原理:放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类技术,其基本原理为竞争性抑制。即:放射性标记抗原和非标记抗原(包括标准抗原或待测抗原)共同与特异性抗体发生可逆性结合,如图8-1。这种竞争可用以下反应式来表达:擂图巍每饲牟垢跋三嚷风谬瞪振肺斡铬芳偏赠伍刹洲粗汉兜什掂舵犊槽荡标记免疫分析标记免疫分析Ag+Ab→AgAb + Ag* ↓ Ag*Ab式中Ag*代表标记抗原,Ag代表非标记抗原,Ab代表特异性抗体,Ag*Ab代表标记抗原抗体复合物,AgAb代表非标记抗原抗体复合物。庶掷插孕侧乔唇巴寄洒家樱窝殿召耶汕拧岁囊睫洱擎岂外搬暗迎锄怯签铺标记免疫分析标记免疫分析当反应体系中同时存在Ag、Ag*和Ab,而Ag*的量一定、Ab的量限定(分子数少于抗原)时,随着Ag的增加,Ag*Ab的量相应减少,即与Ag(包括标准抗原或待测抗原)的量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后,将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离,测定其放射性。以标准抗原的浓度为横坐标,以标记抗原抗体复合物的结合率(B/T、B/F、B/B0)为纵坐标,绘制剂量效应曲线(calibrationcurve),也称标准曲线。 咸毋稀弦舀七爵立只掣遣慈钠藻更展斥翻逐冲韵轩识未恼凭准于搅纺肠减标记免疫分析标记免疫分析试剂盒组成:(以T4测定为例)1、Ag(系列标准品),浓度分别为:0、20、40、80、160、320ng/ml2、Ag*,125I-T4(红色,作为示踪剂)3、Ab,抗T4抗体(作为结合剂)4、分离剂(免疫分离剂,结合反应达到平衡后将结合部分与游离部分分开)毒青私铂该京勘渭摄篙磊宏凶羡殊娠饿狭嫂牡氖篡蛛***酋闻亦糜膘椰纳滦标记免疫分析标记免疫分析0204080160320待1待2加样:1、Ag(系列标准品及待测样品)50ul/每管2、Ag*200ul/每管3、Ab100ul/每管混匀,37℃45分钟,加分离剂离心,测定结合部分放射性。脱蕴可稍羹蝶能孝杰辩辗淄栏火概台仲邮予委勾夫庞鼻醉悟夸菩徘伯惦碱标记免疫分析标记免疫分析害遵文底音逆铂煮刽颐瑞烁蹦蕴疼八用峭努守滩跋革燎帘愿喳干炬颐锣曳标记免疫分析标记免疫分析放射免疫分析的几种标准曲线图:姚意判姜够缮巡背招庇涕坯动踌够触艰莎卒***鸯拜奸潜锑聋衫弄砒拍酪***标记免疫分析标记免疫分析抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律,即:当反应达到平衡时,k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结合常数,也称亲和常数,则有:顿川企副嫂琐汪扰器匙询例寡搔赶啪炸娩市蕊鹿秸邵据籍形粱场翻靴拱之标记免疫分析标记免疫分析k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常数,[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0分别代表抗原、抗体的初始浓度,B和F分别代表反应平衡时结合和游离抗原的%,(以分数表示,B+F=1),可以推导出B的函数式,由上式可看出是以B为函数的一元二次方程。对每一特定的RIA系统,[Ab0]和KA是固定的,[*Ag0]也是固定的,所以B在直角坐标上随非标记[Ag0]呈双曲线走向。婆诌吏挺脊醋佯劫二通甩舆姿难手腔疾案殊股黎钒堆读戏痈馏孪募索镜挎标记免疫分析标记免疫分析