文档介绍：薇〔Ⅱ〕实验部分莅薂实验一蛋白质含量测定法肁羈本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。肇蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。蚅值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。膁考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。荿一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法蒅样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:莄CH2COOH膀|+3H2SO4®2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)螀NH2芇膃2NH3+H2SO4®(NH4)2SO4(2)芀(NH4)2SO4+2NaOH®2H2O+Na2SO4+2NH3(3)膁蚅反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。芆为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。莀计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白芈氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,。莇羅蒀虿五种蛋白质测定方法比较如下:聿螄方法薀灵敏度肀时间薆原理薂干扰物质蚀说明薀凯氏定氮法芈(Kjedahl法)薅灵敏度低,~,误差为±2%螀费时蚇8~10小时螆将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定莄非蛋白氮(可用三***乙酸沉淀蛋白质而分离)螀用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长肈双缩脲法(Biuret法)蒈灵敏度低肃1~20mg膃中速葿20~30分钟袆多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物膆硫酸铵;芃Tris缓冲液;袀某些氨基酸蚈用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似袅紫外吸收法莃较为灵敏芁50~100mg肆快速蚄5~10分钟莃蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收莈各种嘌吟和嘧啶;螇各种核苷酸蒃用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正蒃Folin-酚试剂法(Lowry法)蝿灵敏度高芅~5mg蒅慢速薃40~60腿分钟羇双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原芄硫酸铵;蚃Tris缓冲液;薀甘氨酸;蒅各种硫醇羃耗费时间长;操作要严格计时;螃颜色深浅随不同蛋白质变化螇考马斯亮蓝法(Bradford法)***灵敏度最高螂1~5mg袂快速膈5~15分钟薅考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm螅强碱性缓冲液;羂TritonX-100;芇最好的方法;薄干扰物质少;羂颜色稳定;蕿SDS羀颜色深浅随不同蛋白质变化螅莃肂莁蒆二、双缩脲法(Biuret法)莆(一)实验原理膂双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。=O节HNNH袈R-CHCH-uC=O羃HNNH莂R-CHCH-R艿H2O莈蚂紫色络合物蒂蚀紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。袆此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。螅(二):袇(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标