文档介绍：芇Ⅰ清洗与灭菌肃一、实验目的螀能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒,掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作,了解化学消毒法的使用方法。罿二、实验原理蚄清洗与消毒是组织培养实验的第一步,是组织培养中工作量最大,也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿,不仅要求干净透明,无油迹,而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质,,也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要,对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对,即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。膅三、实验材料、用品膂材料:无臭氧型紫外灯,微孔滤膜(直径25):,微孔滤膜(直径90):,过滤器(直径25)。莈药品:70%或75%酒精,%新洁尔灭,煤酚皂溶液(来苏儿水),%过氧乙酸,乳酸,37%甲醛,高锰酸钾,NaOH,盐酸,***钾,浓硫酸(工业),DEPC水[%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。蒄仪器:超净台,干燥箱,高压锅,过滤器,过滤泵。羂四、实验步骤芁(一),再浸泡5%稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。(1)使用过的培养用品应立即浸入清水,避免干涸难洗。荿(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿,自来水清洗数遍,倒置自然干燥。芇(3)浸酸性洗液过夜。羅(4),蒸馏水涮洗3次,倒置烘干。肅(5)包装(牛皮纸或一般纸)。螁(6)高压(15磅20min)或干热(170℃2h)灭菌。蚆(7)贮存备用。(1)%NaOH煮沸lO-20min。袀(2)自来水清洗10次。荿(3)再用1%稀盐酸浸泡30min。蒅(4)自来水清洗10次,蒸馏水涮洗3次。晾干,高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次,过蒸馏水,晾干,包装并高压灭菌后,便可使用。羄(二)(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿,如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。膆(2)干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内,加热至160℃,保温90-120min。用于RNA提取实验的用品则需180℃,保温5-8h。螁(3)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌,是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下:莀①首先查看高压锅内的水是否充足,放人物品盖好盖。芈②加热高压锅。将放气阀打开,放气5—10min,以排除锅内的冷空气。袆③待锅内水沸腾后,落下放气阀继续升温升压,玻璃器皿等用15磅(121℃)30min,胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115℃)20min。调节火力大小保持该压力。螂④停止加热,待压力自然下降至0再打开放气阀排