文档介绍：莇蛋白酶的盐析沉淀实验报告莈班级:生工1005学号:00姓名:朱同辉芃实验目的:;;;。肂实验原理:薀盐析法薅在蛋白质溶液中加入少量中性盐,蛋白质溶解度增加,称为盐溶;而加入大量中性盐达一定浓度,蛋白质就会沉淀,称为盐析。莅原理:①大量盐加入后,能与蛋白质争夺水分子,去除水膜;螂②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷,使分子间静电斥力减弱,疏水作用增强,使蛋白质沉淀。莇盐析效果:二价离子>一价离子羇离子半径小>离子半径大袅阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+蒃阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-荿蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn经验式来表示:肅式中:S—蛋白质的溶解度芄I—离子强度罿β—常数,与温度和pH有关蒀Ks—盐析常数,与蛋白质和盐的种类有关蒈其中I根据下式计算:蚃式中:ci—i离子的浓度(mol/L)蝿zi—i离子所带的电荷芈蛋白酶活力的测定薆福林(Folin)试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物,蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸,将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用,根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量,从而推断酶活力的大小。肃蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算蒀K—(μg),—酶液稀释倍数蚄4—酶反应液为4ml,取出1ml测定,故乘以4薂10—反应时间为10min芀参考稀释倍数:原酶、饱和度20%,30%,40%,50%,60%,70%的上清液分别为1000,200,150,100,100,100,50倍莀实验步骤:肇1)蛋白质盐析羂分两个大组进行实验,每大组取6只烧杯编号,分别加入50ml蛋白酶液,,,,,(对应20%,30%,40%,50%,60%,70%饱和度),在磁力搅拌器不断搅拌下,将其缓慢加入酶液中,加完后再搅拌5min,使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀完全。羁将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中,在天平上称重平衡,用高速冷冻离心机离心于10℃,10,000r/min离心20min。膈将上层清液倒入量筒记录其体积,并分别测定酶活(u/ml),即为该酶的溶解度S。膅2)蛋白酶活力的测定:%酪蛋白溶液40℃预热3-、1、2,分别吸取待测酶液1ml放入试管中,40℃水浴中预热1-***醋酸2ml,再往3支试管中加入2%酪蛋白1ml,计时摇匀,40℃、***醋酸2ml,摇匀,,分别吸取上述清液1ml,,福林试剂1ml,于40℃水浴中保温20min显色。,在波长680nm处测定1、2号管的吸光度,求出平均值。羆3)蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算蚆计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓度,离子强度,蛋白酶溶解度和上清液酶活残留,并填表。蒄