文档介绍：免疫荧光技术基本原理:免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗体,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色),可以看见荧光所在的组织细胞,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。应用范围:其应用范围极其广泛,可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别,又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。常见荧光色素:许多物质都可产生荧光现象,但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有:(一)***酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水或酒精等溶剂。,最大吸收光波长为490495nm,最大发射光波长520530nm,呈现明亮的黄绿色荧光,结构式如下:有两种同分异结构,其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好,在冷暗干燥处可保存多年,是应用最广泛的荧光素。其主要优点是:①人眼对黄绿色较为敏感,②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。(rhodamine,RIB200)为橘红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和***。性质稳定,可长期保存。结构式如下:最大吸收光波长为570nm,最大发射光波长为595~600nm,呈橘红色荧光。***异硫***酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)结构式如下:最大吸引光波长为550nm,最大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。其异硫***基可与蛋白质结合,但荧光效率较低。(二),一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-***伞***-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-***伞***,后者可发出荧光,1激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-***伞***磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基***等。(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光,其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,最适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器:荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器激光共聚焦显微镜荧光偏振免疫分析用偏振光激发标记物,利用结合竞争免疫原理,可以快速检测激素种瘤标志物、维生素和多种治疗药物浓度。而且用于鉴定的材料也比较多样,可以是培养物、感染组织、分泌排泄物,也可以是土壤、水、杂物等。应用于生物酶含量及活性测定、临床医学检验、食品分析和环境监测、毒品检验。一、时间分辨荧光免疫测定以常用荧光素作为标记物的荧光免疫测定往往受血清成分、试管、仪器组件等的本底荧光干扰,