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临床细菌检验工作的基本要求和技术
对临床细菌检验人员的要求
负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。
一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。
通晓细菌室守则,并严格遵守。
负责人应不断更新知识,了解细菌学检验的新进展。
定期或随时与临床医师联系,主动参与临床病例讨论,了解病情及治疗情况,达到细菌检验与临床的密切联系。
工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种,增强自身抵抗能力。
二、工作人员守则
在细菌室工作人员应注意,既不要给室内带来污染,也不要被室内的微生物感染。工作人员必须遵守以下规则:
穿专用的工作衣、帽入室;必要时应戴口罩。
不允许无关人员进入实验室。
室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。
养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。
操作中不可说话,以免口中飞沫污染标本。
每次完成工作和离开实验室前,应用肥皂洗手,接触了致病菌类,须用消毒剂消毒手。
个人物品不许带入室内。
当工作环境被细菌培养物污染,必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物,并报告主管人员采取必要的措施。
工作人员被细菌培养物污染,应用弱或中等消毒剂清洗,必要时应给予药物治疗,并向主管负责人报告,进一步采用特殊措施。
基本染色方法

染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时,用接种环沾取菌液点在载玻片上,标本可直接在玻片上涂布。菌落涂片时,先取生理盐水 1滴,置玻片上,用接种针挑取菌落,在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式,或造成细菌鞭毛脱落,影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥,并经火焰固定,固定温度不宜过高,以玻片背面接触手背不烫为准,否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。
一、革兰染色
本染色是最基本的染色法,可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
试剂
1. 结晶紫溶液
A液: 结晶紫 2g
95%乙醇 20ml
B液: 草酸铵
蒸馏水 80ml
需在用前24h将A液、B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。

碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水 300ml
碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升水,使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。
也可用少量蒸馏水,先将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。
:95%乙醇。

A. 贮存液: 沙黄
95%乙醇 100ml
B. 应用液: A液 10ml
蒸馏水 90ml
染色方法:
,加结晶紫液染1 min,清水冲去染液。
min,水洗。
,不时摇动约10~30s,至无紫色脱落为止,水洗。
,染30s,水洗。
。
二、抗酸染色
抗酸染色直接用于痰标本时,可以适当增加标本涂片的厚度,以提高检出率。染厚涂片时,须掌握复染色时间。如果背景过深,影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性,取培养菌落涂片染色时,呈现两种现象,视野中有些菌细胞阳性,另外一些则阴性;有时同一个菌体上,红色的深浅亦有不同,观察时应予注意。
抗酸染色有两种常用方法:①碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。②荧光染料金胺O法(也称金胺
O-罗丹明B法)。
碱性复红染色法
试剂

碱性复红乙醇饱和溶液 10ml
5%石炭酸溶液 90ml
*
浓盐酸 3ml
95%乙醇 97ml
(吕弗勒美蓝液)
美蓝乙醇饱和溶液 30ml
10%氢氧化钾
蒸馏水 100ml
染色方法
,加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现,切不可沸腾。染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间),水洗。
,不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗。
,~l min,水洗。
。分枝杆菌呈红色,背景为蓝色。
*:奴卡菌、放线菌标本染色时,脱色剂改用2%硫酸水溶液。

(二)金胺O-罗丹明B染色法
染剂
:罗丹明B ;
%金胺O液:金胺O ,再加入纯石炭酸5ml,混匀;
%盐酸酒精;
:吕弗勒美蓝液10ml,加蒸馏水90ml,混匀。
方法
涂片固定后加第1液30~90s。
弃去第1液后加第2液染15min。
用第3液脱色1~2min,水洗。
滴加第4液染30s,水