文档介绍：质粒DNA的提取鉴定掌握碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA原理和方法。掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。一、实验目的质粒(plasmid)是一种独立的稳定的遗传因子,存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子,大小从1kb到200kb不等,具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息,但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质,而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此,质粒是一种寄生性的自主复制子。细菌质粒是基因工程中常用的基因载体,也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。二、。,染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性;质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离,,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,以可溶性状态存在于液相中,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的网状结构,与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。二、实验原理抽提中各种因素的影响,质粒DNA可能以三种形式存在:(cDNA),常以超螺旋形式存在;(opencircularDNA,ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂,形成缺刻,可以自由旋转从而消除了张力,形成松弛的环状分子;(linearDNA,lDNA),质粒DNA的两条链在同一处断裂所形成。在电泳时,同一质粒DNA的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环,cDNA含量越高,表明制备的质粒DNA质量越好。三、操作步骤详见189-190页50mM葡萄糖25mMTris-HCl10mMEDTA-Na2200mMNaOH1%(W/V)SDS3mMKAC25~10min30min以上不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同,在电泳时的泳动速率就不同,从而可以区分出不同的区带。核酸构型不同,在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNA的泳动速度次序为:共价闭环DNA>开环DNA>线状DNA。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在波长254nm紫外光照射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光,所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。四、:%的琼脂糖凝胶。,加入30ml电泳缓冲液,置于微波炉使其充分融化。室温放置至60℃左右,,混匀,倒胶板(30ml/板)。:用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高4mm的墙,在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上,迅速将上面胶液倒在模板的中央,让胶液自由流向四周。待胶液充分冷却凝固,将胶纸围墙慢慢取下,制备好的凝胶板放入电泳槽中,加电泳缓冲液直至没过胶面约1mm深,取出样品梳。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤