文档介绍：实验三 酵母菌RNA的提取、鉴定及定量测定
一、实验目的
掌握稀碱(NaOH)法分离酵母RNA的原理与方法
了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。
二、实验原理
(一)目前常用的RNA的制备方法
浓盐法:是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。成本低、适于大规模操作。
稀碱法: 是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。提取的RNA有不同程度的降解。稀碱法的提取时间短,提取率高于浓盐法,更利于工业化生产。
(二)实验材料的选择
酵母细胞富含核酸,且核酸主要是RNA,%-%,而DNA含量较少,%-%。为此提取RNA多以酵母为原料。
(三)RNA的化学组成的鉴定
(1)嘌呤碱鉴定:与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。
(2)核糖的鉴定:地衣酚(3,5—二羟甲苯试剂)显色法
(3)磷酸的鉴定:与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓]。
(4)脱氧核糖的鉴定:与二苯胺试剂反应生成蓝灰色沉淀,如没有沉淀产生,说明没有DNA.
三、试剂
1. 干酵母粉。
。 。
%乙醇。 %硫酸。
6. 浓氨水。
7. 50g/L硝酸银溶液。
(3,5—二羟甲苯试剂): 100ml,加入FeCl3·6H20 100mg及二羟甲苯100mg,混匀溶解后,置于棕色瓶中,此试剂必须在临用前新鲜配制。市售的3,5—二羟甲苯不能使用,必须用苯纯化结晶l~2次,并用活性炭脱色方可使用。
:%钼酸铵溶液:,加5mol/L H2S0430ml,用水稀释至l00ml,此试剂可在冷处保存一月不变质。
10. 10%抗坏血酸(Vc)溶液: 10g抗坏血酸溶于100ml水。贮棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用,如呈深黄色即失效。
: (如不纯,须在70%乙醇中重结晶2次),溶于100ml冰醋酸(AR)中,, 摇匀,贮在棕色瓶中放冰箱内保存备用。
(钼酸铵—过氯酸试剂):%%过氯酸中。如配200ml,即在 193ml水中加入7m170%。
四、操作步骤
:每二人用大试管取1g干酵母, NaOH溶液5ml提取,放入试管沸水浴加热30分钟,并经常搅拌。
待冷却后加入乙酸5~8滴,使提取液呈酸性(石蕊试纸),移在离心管里,离心10分钟(3500转/分)。
将上清液倒入另一离心管中,加入95%乙醇2ml,边加边搅。加毕,离心10分钟,即可得到核酸钠的白色沉淀。
:在含有核酸钠的离心管中加入5%硫酸2ml,用玻棒搅匀,沸水浴煮10分钟。
其中1ml水解液放进EP管里,贴好标签冷冻保存(下次试验用)