文档介绍：核酸的测定方法
一、紫外分光光度法
二、ECL法
三、共振光散射法
四、荧光探针菲啶溴红法
五:地衣酚法测定RNA含量
一、紫外分光光法(定磷法)
原理:①元素分析表明,%,%,由此可以推导出核酸质量约为其含磷量的11倍,因此可从测得的核酸样品的含磷量计算核酸的含量。②DNA、RNA分子在强酸作用下降解的糖,再与浓酸、酚或***生成的有色化合物,其颜色深浅与核酸含量呈正比,因此通过比色法可测得核酸的含量。
仪器:分析天平、离心机、容量瓶、紫外分光光度计、吸管等
试剂:氨水、钼酸铵-高***酸
注意事项:因为蛋白质含有芳香族氨基酸,故也能吸收紫外光,通常吸收峰在280nm处,在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低,若样品中蛋白质含量较低时对核酸紫外测定影响不大,若蛋白质含量较高时,会影响核酸含量的测定,故应去除蛋白质的干扰。
二、ECL法
ECL(电化学发光分析):将电化学和化学发光完美结合的新型免疫分析技术电化学发光技术(electroehemiluminesenee,ECL),同时联合新型的免疫固相放大技术—链霉亲和素系统,在免疫学检浏中尤其是核酸测定中,发挥了以往的发光技术无可比拟的优势。
仪器:ECL测量室、磁性微球、电极等
注意事项: ECL技术是电化学技术和化学发光技术相结合的新型免疫分析方法,与普通的化学发光(酶促发光或生物发光),在极表面通过三角形脉冲电压的激发产生稳定、连续、高效的发光,后者则是标记辣根过氧化物酶作用下催化化学发光剂如鲁米那,吖啶酶等产生不稳定、间断、闪烁性的发光,且反应过程中容易发生裂变而使结果不稳定。ECL测定的照光度根据释放光于的,波长仍属荧光测定的范畴,但与直接的荧光发光不同,荧光发光的灵敏度蹙荧光发光的本底和光学部件散射光的影响,适应范围也较低。
三、共振光散射法
原理:在普通荧光分光光度计上进行测量的分析技术,灵敏度高、简便快速。该技术可以用于研究核酸与有机小分子探针间的相互作用并进行核酸的定量测定。在核酸测定分析中,该方法的灵敏度主要取决于探针分子与核酸作用的强弱,因此寻找灵敏的核酸测定的探针成为核酸分析的重要内容
仪器:F-2500型荧光分光光度计,QL-901型旋涡混合器,pHS-3C酸度计
试剂:fsDNA储备液、溴化十六烷基三甲铵、依来铬蓝黑、Britton-Robinson缓冲液、M/25混合酸
注意事项:缓冲溶液(BR)加入的顺序对RLS强度影响不大,而染料加入的顺序则很关键。主要是由于阳离子表面活性剂CTMAB首先与大分子fsDNA以静电引力结合,再进而与染料结合形成离子缔合物而使RLS强度明显增强。在实验中,凡最后加入染料的组合其RLS信号都特别强,即CTMAB与fsDNA作用之后再让染料聚集,所获RLS信号更强。所以试剂加入的最佳顺序应是先加入fsDNA和CTMAB,最后再加入染料
四、荧光探针菲啶溴红法
原理:常温下核酸自身荧光很弱,不能直接探测到。利用荧光探针—菲啶溴红( 简称Eth Br )插入核酸的双链区时,其量子产率大大增高,它和核酸形成一种较强的荧光络合物。在一定条件下,/ 毫升
仪器:荧光分光光度计、MPF-4型荧光分光光度计、组织匀浆器
试剂:菲啶溴红、核搪核酸钠盐、广谱蛋白酶、三羟***氨基甲烷、Eth Br溶液、Tris一HCL缓冲液
注意事项:这种方法也有一定的局限性,如荧光测定实验条件严格;不能侧定失去双链区的核酸;匀浆样品中若干扰物质(如蛋白质等)的含量大大超过核酸含量时,对于结果有影响。但是利用这种荧光方法测定微量核酸具有明显的优点;简便、快速、灵敏和专一性强。