文档介绍：,,,是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(***)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后,在3000r/min的条件下离心5min,即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行,如果在室温下,要迅速分离和观察。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态,从激发态回到基态时,就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光),这种光就称为荧光。若停止供能,荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后,可直接发出荧光(称为自发荧光),如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光,但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光),如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。:1)主要设备:普通离心机,粗天平,荧光显微镜;2)小型器材:剪刀,研钵,移液管,漏斗,滴管,10ml刻度离心管,纱布若干,无荧光载玻片和盖玻片。:新鲜菠菜。:***化钠溶液,%吖啶橙(acridineorange).%吖啶橙的配制:,贮棕色瓶,置4℃冰箱保存。放冰箱备用,临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液()9ml稀释。吖啶橙(AcridineOrange,AO)是一种荧光色素,其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别,可发出不同颜色的荧光(即着色特异性),这是由于DNA是个高度聚合物,吸收荧光物质的位置较少,发绿色荧光,而RNA聚合度低,能和荧光物质结合的位置多,故发红色荧光。(1)选取新鲜的菠菜嫩叶,洗净擦干后,去除叶梗及粗脉并剪碎,称取2g左右,置于预冷的研钵;(2)•L-1NaCl溶液研磨匀浆;(3)用6层纱布过滤,滤液盛于烧杯中;(4)取滤液4ml于1000rpm离心2min,弃去沉淀;(5)将上清液3000rpm离心5min,弃去上清液,沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核);(6)-1NaCl溶液悬浮。(1)取叶绿体悬浮液一滴滴于载片上,加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。(2)在普通光镜下观察,注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。(3)在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光,其颜色如何。(4)取叶绿体悬浮液一滴滴在无荧光载片上,%吖啶橙荧光染料,加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。:要得到完整的、有活性的叶绿体,须低温下迅速提取,涂片后立即观察。:,自发荧光和次生荧光的区别??操作过程中应注意什么?实验二吖啶橙(acridineorange)。。。其吸收光谱405nm,发射的荧光光谱是530~640nm,因此,吖啶橙和不同的细胞成分结合后,可发射红橙黄绿蓝各色荧光。:荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签;:口腔黏膜上皮细胞临时制片;:1)。A液:NaH2PO4·;B液,Na2HPO4·;、、。2)%吖啶橙原液:。%吖啶橙染液:%。3)95%;%乙醇溶液固定5min;%吖啶橙染液染色5mi