文档介绍：原理限制性内切酶介导的整合(RestrictionEnzymeMediatedIntegration,REMI)技术是一种将待转化的DNA通过限制性内切酶介导整合到真核生物细胞染色体中的方法,在真菌中已经发展成为有效的转化和标记突变的方法。用REMI技术已经标记和分离出几种植物病原真菌的致病性相关基因。如玉米小斑病菌CochliobolusheterostrophusT小种的产***基因Tox1和T***生物合成所需要的直线聚乙***醇(1inearpolyketide)合成酶基因PKS1(;);梨黑斑病菌Alternariaalternata日本梨致病型菌株中与AK***产生和致病性必需的2个基因Akt1和Akt2()等。在稻瘟菌中,利用REMI技术已克隆了10多个致病相关基因,如Pth11、CUT1、MPG1、CPKA等(al.,1999;Sweigardetal.,1998;LauandHamer,1998;Xuetal.,1997;Balhadereetal.,1999)。在稻瘟菌的REMI转化以获得突变体中,转化用的质粒以随机的方式插入到稻瘟菌的基因组中,这个质粒除了带有一个真核选择标记如潮霉素抗性基因外,仍然具有细菌质粒的复制位点和抗性基因。拯救就是将此质粒及它所插入位置的侧端序列从基因组中拿出来的过程。其原理图如下:或Insertedplasmid选用合适的限制性内切酶完全消解基因组DNA,进行DN***段的自身环化后,再转化大肠杆菌,包含有细菌质粒的复制位点和抗性基因的环化的DN***段就能在抗性平板上长出。根据所选用的限制性内切酶的不同可分为两种不同的策略,一种是选用REMI转化所用的质粒中有一个酶切位点,且不破坏细菌质粒的复制位点和抗性基因的限制性内切酶,在这种策略中被拯救的质粒中带有插入位置一侧的稻瘟菌基因组DNA序列,如上图中向左的箭头所指;另一种策略是选用REMI转化所用的质粒中没有酶切位点的限制性内切酶,在这种策略中被拯救的质粒中同时带有插入位置两侧的稻瘟菌基因组DNA序列如上图中向右的箭头所指。这样,通过质粒拯救就能获得部分插入位置的侧端序列。实验材料和设备实验材料:突变体X54的基因组DNA;限制性内切酶HindIII,EcoRV(Takara,大连);T4DNA连接酶(Takara,大连);苯酚:***仿(异戊醇),3M醋酸钠,70%乙醇,无水乙醇,TE(),ddH2O;培养基:LB,SOB(配方参照《分子克隆》第二版)电击感受态细胞JM109;实验设备:恒温水浴台式高速冷冻离心机电击转化仪实验步骤用合适的限制性内切酶酶切5-10ug基因组DNA。待酶切完全后,用苯酚:***仿抽提以失活限制性内切酶。加入1/10体积3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇,-20℃沉淀一小时以上。13000rpm,4℃离心15分钟,去上清,沉淀用70%乙醇洗两遍,无水乙醇洗一遍,自然晾干或真空抽干。用50-100ulTE溶解DNA。在下列反应体系中16℃连接过夜。ddH2O78ul10xbuffer10ulT4DNA连接酶2ulDNA10ul(1ug)65℃处理10分钟,以失活T4DNA连接酶。加入1/10体积3MNaAC和2倍体积无水乙醇,-20℃沉淀一小时以上.