文档介绍：质粒dna的提取实验报告思考题篇一:质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题 : (1)通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒; (2)通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术; (1)实验仪器(apparatus): 恒温培养箱(Constanttemperatureincubator)、恒温摇床(Constanttemperatureshakingtable)、高速离心机(Highspeedcentrifuge)、漩涡振荡器(Vortexmixer)、超净工作台(Bechtop)、高压灭菌锅(Autoclave)、微量加样器(Pipettes)、烧杯(beaker)、量筒(graduatedcylinder)、玻璃棒(stirbar)、微波炉(microwave)、天平(Panbalance)、电泳梳子(xxb)、电泳槽(electrophoresistank)、电泳器(Electro-phoresisSystem)、紫外灯(Ultraviolettransilluminator) 3)、材料与试剂(Reagents): ①溶液I(SolutionⅠ): 50mmol/L葡萄糖;25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCl();10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) 溶液I可成批配制,每瓶约100ml,10磅高压蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。②溶液Ⅱ(SolutionⅡ):新鲜配制,等体积混合 (临用前用10mol/L贮存液现用现稀释);1%SDS(可用10%贮存液稀释配制)注意:SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌。③溶液III(SolutionⅢ,100mL):加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL5mol/LKAc, , (该溶液钾离子浓度为3mol/L,醋酸根离子浓度为5mol/L) ④TE液缓冲液:10mmol/LTris-HCl();1mmol/LEDTA() ⑤70%乙醇; ⑥平衡酚:氯仿1:1: 将量取25mlTris-HCl()平衡苯酚,加入24ml氯仿和1ml异戊醇,充分混合后,移入棕色玻璃瓶中,4℃保存。⑦LB培养基: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl15g ⑧琼脂糖(Agarose); ⑨1liter(升)5×TBE备用溶液(stocksolution): 54gtrisbase,(boricacid),,; ⑩6×凝胶加样缓冲液: %溴酚蓝(bromophenolblue),40%蔗糖(sucroseinwater); 另外还有的试剂是:胰RNA酶、DNAMarker、硼酸、Gelview试剂(2)实验材料:含有pUC19质粒的大肠杆菌等。 : 1)质粒DNA的提取: (1)关于质粒: 质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外(细胞质中)呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等,且拥有自己的复制起始位点,可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制,而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。(2)一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤: ①培养细菌,使质粒DNA大量扩增; ②收集和裂解细菌; ③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。(3)碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理: 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。~,线性的DNA双螺旋结构解开而变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确;而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型,保持可溶性状态。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。 2)质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳: (1)关于电泳技术: 电泳