文档介绍：BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定
【关键词】 BMPsⅡ型突变受体
关键词: BMPsⅡ型突变受体;真核表达载体
0 引言
骨形成蛋白(BMPs)不仅在骨,软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用,而且起着十分重要的调控作用[1] .与其他TGF-β超家族成员一样,BMPs在细胞表面与BMP的Ⅰ,Ⅱ型受体相互作用,Ⅰ型受体可以和过量的配体结合,而Ⅱ型受体与配体的结合则是特异性的[2] .tBRK3k为BMPsⅡ型突变受体,其可以阻断BMP的信号转导,这样,BMP就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育,,为研究BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用,我们构建了BMPsⅠ型突变受体的真核表达载体,为此方面研究的开展奠定了基础.
1 材料和方法
材料 pSP64TL-tBRK3k质粒为含有BMPsⅡ型突变受体cDNA的克隆质粒,由日本的Nohno教授(Kawasaki医学院分子生物所)(neo).
酶切鉴定及回收[3] 将pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3(neo)用HindⅢ和XbaⅠ双酶切,%,,.
连接、转化和克隆筛选[3] 取上述tBRK3k片段5μL和pCDNA3(neo)片段各2μL,加入T4DNA连接酶、缓冲液和无菌水各1μL,16℃,液体LB培养基37℃振摇过夜,小提质粒,酶切鉴定筛选出阳性克隆,命名为pC-4.
2 结果
pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3的酶切鉴定 pSP64TL-tBRK3k质粒经双酶切后,;pCDNA3(neo)经双酶切后,,符合二者的物理图谱(图1).
图1 略
pC-4的酶切鉴定 pC-4经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后,,证明tBRK3k基因已成功连入到pCDNA(neo)中(图1).
3 讨论
TGF-β超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用,分别叫做Ⅰ型受体(约50~55KD)和Ⅱ型受体(约70~80KD)[4] .和其他TGF-β超家族成员一样,BMPs在细胞表面与Ⅰ,Ⅱ型受体相互作用.Ⅰ型受体可以和过量的配体结合,而Ⅱ,为研究BMPs信号转导在机体发育中的作用,我们将突变型BMPsⅡ型受体(tBRK3k)定向克隆到pCDNA3(neo)表达载体中(图2).
图2 略
pCDNA3(neo)可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因,:CMV启动子,SV40复制起始点,SV40polyA,SV405’端和3’端剪切序列等,多聚接头有11个可供利用的单一