文档介绍：mBMP┐4真核表达载体的构建及表达
作者:孟国林,胡蕴玉,谭祖键,金明,吕荣
【关键词】骨形态发生蛋白
关键词: 骨形态发生蛋白;载体;基因治疗
0 引言
骨形态发生蛋白-4(BMP-4),将外源基因转入靶细胞内,-4表达载体,并观测外源基因在细胞内表达的情况,为探索将基因转移技术应用于骨折及骨不连等疾病的治疗奠定一定的实验基础.
1 材料和方法
试剂
质粒pcDNA3和pSPT-18-mBMP-4均由吕振华博士馈赠,EcoR I和HindIII,T4DNA连接酶、溴化乙锭(EB)、RNAase购自华美公司,普通琼脂糖、脂质体(lipofec-tamin)、G418、DMEM购自Gibco公司,胎牛血清购自Hy-clone公司.
仪器
CO2 孵箱,CO2 培养箱,低温冷冻高速离心机,空气恒温摇床,水平电泳仪,Tanon GIS凝胶图像处理系统等.
真核表达载体pcDNA3-mBMP-4的构建和鉴定
氯化钙法将pSPT-18-mBMP-4质粒转化大肠杆菌感受态细胞HB101,氨苄青霉素筛选后挑选阳性菌落扩增,小量提取mBMP-4质粒并用EcoR I和HindIII消化,12g・L-1 琼脂糖电泳, mBMP-4片段;;采用T4DNA连接酶定向克隆mBMP-4到真核表达载体pcDNA3中;将构建好的载体转化到大肠杆菌HB101中并大量扩增、回收、纯化;EcoR I和HindIII消化新构建的质粒,12g・L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定,使用λDNA/Hind III marker,溴化乙锭显色.
真核表达载体pcDNA3-mBMP-4转染NIH3T3细胞及其表达的检测
采用脂质体(lipofectamine)转染法将真核表达载体pcDNA3-mBMP-4转入NIH3T3细胞内(本实验室冻存),G418(350μg・mL-1 )筛选转染阳性细胞;-4在mRNA水平中的表达.
2 结果
真核表达载体pcDNA3-mBMP-4的酶切鉴定
EcoR I和HindIII消化pcDNA3-mBMP-4,12g・L-1 琼脂糖凝胶中和
λDNA/HindIII Marker一起电泳,溴化乙锭显色,可见有 ,其中前者代表mBMP-4DNA片段,后者代表pcDNA3片段,符合物理图谱,说明载体构建成功(图1).
mBMP-4在NIH3T3细胞内的表达
转染真核表达载体的NIH3T3细胞在G418筛选的早期表现为大量细胞死亡,,转染后20d在培养瓶内生长到指数生长期的末期;以后阳性细胞均在G418筛选