文档介绍：不同来源肝干细胞的分选方法作者:吕刚1,卫立辛2,蒲永东1,吴孟超2 作者单位:1解放军第309医院(总参谋部总医院) 普通外科(北京 100091) 2上海东方肝胆外科医院肿瘤免疫治疗中心(上海 200438) 【摘要】肝干细胞是一类具有干细胞特征并且能向肝细胞和胆管细胞分化的细胞,具有无限的增殖能力及多向分化潜能。肝干细胞可以来源于胚胎发育过程中出现的胎肝干细胞,成年肝内存在的肝干细胞及其子代细胞卵圆细胞、小肝细胞、肝星状细胞以及特定情况下肝外来源的细胞(如骨髓、胰腺、脐血、胎盘)等。近年来如何分离和鉴定这一小群细胞成为研究的热点。由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势,因此探讨获取肝干细胞的方法有重要的现实意义。本文就近年来对不同来源的肝干细胞的分选方法进展做一综述。【关键词】干细胞,肝,分选,标志物肝脏是一个具有强大再生能力的器官,但是除了成熟的肝细胞参与了肝脏的再生修复之外,其他细胞是否参与修复过程在很长时间内不为人所知。近些年来有学者通过一系列设计巧妙的实验,证实了肝前体细胞的存在,并且提出了肝干细胞学说[1-2]。从定义上,肝干细胞应当具有干细胞的所有特征,主要体现在无限的增殖能力及多向分化潜能两方面。目前研究认为,体内多种细胞符合肝干细胞的特征,主要有:胚胎发育过程中出现的胎肝干细胞,成年肝内存在的肝干细胞及其子代细胞卵圆细胞、小肝细胞、肝星状细胞,特定情况下肝外来源的细胞(如骨髓、胰腺、脐血、胎盘)等[3]。尽管目前关于肝干细胞的研究如火如荼地展开,但瓶颈问题依然没有解决:如何获得高纯度的肝干细胞?肝干细胞有没有特异性的标志物?本文就近年来对不同来源肝干细胞的分选方法进展做一综述。肝干细胞分离和鉴定主要依赖于细胞的生物学特性和表面的特异性标志物。一般多采用两步胶原酶灌注法结合荧光激活细胞筛选法及免疫磁珠细胞筛选法。后两种方法本质上都是以免疫亲和技术为基础,利用待分离的细胞具有特异性表面标志物的特性,可以被抗体标记后用免疫磁珠颗粒或流式细胞计数等方法分选,并通过对所获细胞进行定向诱导培养后表达肝细胞和胆管细胞的表面标志物(AFP、白蛋白、CK18、CK19)得到证实[4]。 1 胚胎肝干细胞的分选有关胚胎肝干细胞(embryonicliverstemcells,ELSC)分选方法的经验多来自于动物。由于ELSC缺乏特异性的细胞表面标志物,其获得一般先采用阴性选择去除造血细胞、内皮细胞等混杂因素。如Sigal等[5]将孕15d的大鼠胚肝制成单细胞悬液后,先用红细胞抗体去除红细胞,接着用OX-43/OX-44的多克隆抗体去除造血细胞以及内皮细胞,再从剩余的细胞中分选出表达白蛋白和AFP的细胞,最后通过OC-3做标记用流式细胞仪分选出多潜能的肝干细胞。Mariana等[6]对此方法进行了改进,先将Fischer344大鼠胎肝脏置于0℃的不含Ca2+的HBSS液中,再将其轻柔地重悬于含有EGTA的HBSS液中,通过流式细胞仪利用ELSC的特异性表面标志物AFP、白蛋白以及胆管细胞的表面标志物CK19,将分离出的细胞分为3个亚群,最后将所获得的细胞亚群分别移植给2/3肝切除的正常F344大鼠及倒千里光碱(retrosine)处理的二肽基肽酶变异的F344大鼠进行验证,只有同时表达AFP、白蛋白和CK19的细胞群在特定的微环境中才具