文档介绍：专题1 基因工程(一)基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)(1)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。(2)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较:①相同点:都缝合磷酸二酯键。②区别:E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端之间的效率较低。(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。3.“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。(2)最常用的载体是 质粒,其它载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步::编码蛋白质的结构基因。,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。(1)原理:DNA双链复制,酶:热稳定DNA聚合酶(耐热的DNA聚合酶)第二步::使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。:目的基因+启动子+终止子+标记基因(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端。(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步::是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。:将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是:先用Ca2+处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步:,方法是采用DNA分子杂交技术。,方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。