文档介绍：《食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程》河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义(一)食用菌胞外酶活性检测现状食用菌在生长发育过程向培养基内分泌多种胞外酶,胞外酶是一类在细胞内产生在细胞外发挥作用的酶,这些酶将培养基内的纤维素、半纤维、木质素、蛋白等大分子物质分解成小分子物质供菌丝生长发育,胞外酶活性的大小与食用菌种类、不同的生长发育阶段、培养基的理化性质等因素有关。研究胞外酶活性的,了解不同食用菌胞外酶活性的分泌特点、活性大小和变化趋势,推测不同食用菌在不同生长发育阶段对培养基中木质素等大分子营养物质降解动态,对研究提高栽培技术具有重要意义。目前生产中对可人工栽培和非人工栽培食用菌胞外酶活性的检测均有报道,重点检测纤维酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、SOD酶等多种酶类。漆酶主要是由真菌分泌的一类胞外多铜氧化酶,真菌漆酶除了具有降解木质素的作用之外,在色素合成、子实体形成、脱毒以及发病机制等方面都扮演了重要的角色。此外,作为一个氧化酶,漆酶也经常被用在农业、工业和药用等领域。测定漆酶酶活方法测定漆酶酶活有三种方法:分光光度计法、微量热法、脉冲激光光声法,测O2法、高效液相色谱法、极谱法等。分光光度法测定漆酶酶活的基本原理是选定某种漆酶作用的底物,底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基,底物自由基浓度与吸光值成正相关,其在一定的光波波长下存在吸光系数的最大值,依据吸光值随时间变化的关系计算出酶活。微量热法测定漆酶的活性,利LKB-2107Batch型微量热系统,将其温度调至298K,,此方法漆酶的提取物样品用量较少,可直接对酶的悬浮液进行测定,其对反应体系没有任何限制或干扰,适合研究酶促反应中的酶活。纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。传统上将其分为3类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶是一种多组分酶,包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素,CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖,β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原,生成棕红色的氨基化合物,在540nm波长处有最大光吸收,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系,利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。木聚糖是木糖残基以木糖苷键连接而构成的,是植物细胞壁中的半纤维素多糖的主要成分,半纤维素降解酶主要指木聚糖酶系。广义的木聚糖酶是能够水解半纤维素的一个复合酶系的总称,主要的酶包括内切木聚糖酶和木糖苷酶。内切木聚糖酶水解木聚糖成木寡糖和木糖残基,而木糖苷酶则对木寡糖的末端进行水解,释放出木糖残基。木聚糖酶能将底物木聚糖降解成寡糖和单糖,具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算待测木聚糖酶的活力。蛋白酶又称蛋白水解酶,其参与了生物体的多种生物过程。它们不仅能催化底物水解,更能调节蛋白质的定位与活性,调节蛋白质与蛋白质的相互作用,参与胞内信号传导以及新的生物活性分子的生成,目前,蛋白酶的活性分析方法可分为均相检测和分离型检测2种。(二)胞外酶活性检测面临的问题漆酶活性的检测方法较多,很多文献报道了至少5种以上不同的测定方法,生产科研中经常采用分光光度法,分光光度法所采用的底物通常为:ABTS、丁香醛连氮、二茂铁等,不论采用哪一种底物,都有自己的不足和局限。以ABTS为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。它有如下优点:(1)ABTS易溶于水,在室温下放置6个月仍较稳定。(2)其反应只有一步,即从ABTS到它的阳离子自由基。ABTS的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色,且比较稳定,通常在几个小时或几天之内是稳定的。(3)在漆酶的作用下,ABTS有色溶液的摩尔吸光系数较高,说明以其为底物测定的灵敏度较高。(4)到目前为止,还未有报道称ABTS有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性。丁香醛连氮(Syringaladazine)也是漆酶酶活测定较为常见的底物之一。以丁香醛连氮为底物是将其氧化为相应的醌,它的摩尔吸光系数为65000L/(mol•cm)。其摩尔吸光系数较大,可见用它定性测定漆酶的酶活具有较高的灵敏度。采用McIlvaine缓冲体系(pH=),在525nm处测定吸光度的增加。纤维素酶、木聚糖酶活性的检测多数参照文献及饲料行业酶活性检测方法。2005年饲料行业发布了NY/T912-2004《饲料添加剂纤维素酶活性的测