文档介绍：实验四 PCR扩增技术
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术,是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DN***段的技术。此法操作简便, 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝,PCR技术虽然问世仅数年时间, 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域,引起了生物技术发展的一次革命,目前它在分子克隆, 目的基础检测,遗传病的基因诊断,法医学,考古学等方面得到了广泛的应用。
PCR技术实际上是在模板DNA, 引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步:①变性(denaturation);②退火(annealing);③延伸(ex tension),反应过程见图。
模板DNA在94℃条件下变性形成单链; 在55℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合;70℃下在耐热性DNA聚合酶Taq 酶催化下, 在4种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应,如次往复循环30次,由于每次循环目标DNA都以2n次幂扩增,30次循环后目的DNA的量增加106-7倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。要达此目的PCR反应要注意以下问题:
DNA模板:反应中DNA量在50ng~200ng左右。且DNA纯度较高, 以增加反应特异性。
dNTP:反应体系中达100μM~200μM。
Mg2+:Mg2+是Taq酶的辅基,,浓度太低Taq酶活力降低;太高反应特异性降低。
引物:根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右;G+C含量在40 %-70%之间;引物内部不能有回文序列;引物3’端不能互补。
Taq酶:它是从嗜热杆菌中提取的耐热性DNA聚合酶,在95℃时30分钟还有50%活力。
变性温度:在93~95℃之间使模板充分变性。
复性温度:55℃左右,此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定, 它是反应特异性的决定因素。
延伸温度:70~72℃左右,为Taq酶最适反应温度。
10×buffer: 500mM KCl
100mM Tris-HCl ()
% 明胶
1% TritonX-100
MgCl2
4×dNTP: 1mM
引物:actin上, actin下
模板: 20ng/μl