文档介绍：专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过 体外DNA重组和转基因技术, 赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 。基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做 DNA重组技术。(一)基因工程的基本工具“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)功能:能够识别双链 DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中 特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有 专一性。(3)结果:经限制酶切割产生的 DNA片段末端通常有两种形式: 黏性末端和平末端。“分子缝合针”——DNA连接酶两种DNA连接酶(DNA连接酶和DNA连接酶)的比较:①相同点:都缝合磷酸二酯键。②区别:E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而 T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较 低。。与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键。“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件:① 能在受体细胞中复制并稳定保存 。②具有一至多个限制酶切点,供外源 DNA片段插入。③具有标记基因,供重组 DNA的鉴定和选择 。(2)最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核 DNA之外,并具有自我复制能力的双链环状 DNA分子。(3)其它载体: 入噬菌体的衍生物、,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改选的。(二)基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的获取目的基因是指:主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子(2)获取目的基因的 :①从基因文库中获取:基因组文库 或cDNA文库 ②PCR技术扩增③人工合成:化学方法人工合成(DNA合成仪)或反转录法PCR技术扩增(多聚酶链式反应)目的基因(1)原理:DNA双链复制(2)过程:第一步:加热至 90~95℃DNA解链;第二步:冷却到 55~60℃,引物结合到互补 DNA链;第三步:加热至 70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成 。(3)前提:有一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物 。需要热稳定DNA聚合酶(Taq酶)第二步:基因表达载体的构建(核心):使目的基因在受体细胞中 稳定存在,并且可以遗传至下一代 ,使目的基因能够 表达和发挥作用 。组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因1)启动子:是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。(2)终止子:也是一段有特殊结构的 DNA片段 ,位于基因的尾端。1(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中 是否含有目的基因 ,从而将含有目的基因的细胞 筛选出来。常用的标记基因是 抗生素基因。第三步:将目的基因导入受体细胞 _转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。常用的转化方法:导入植物细胞:采用最多的方法是 农杆菌转化法 (农杆菌特点: 易感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力。原理:Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞,并整合到受体细胞染色体的DNA上),其次还有基因枪法和花粉管通道法等。导入动物细胞:最常用的方法是 显微注射技术 。此方法的受体细胞多是 受精卵。导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ,最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ,其转化方法是:先用 Ca2+处理细胞,使其成为 感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步:目的基因的检测和表达首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。 目的基因是否转录出了 mRNA,方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。(分子杂交技术),方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。(三)基因工程的应用植物基因工程:抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。动物基因工程:提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。用转基因动物生产药物:乳腺生物反应器(乳房生物反应