文档介绍：研究生植物生理学
实验教案
教师:王征宏
农学院生物技术系
实验一植物抗氧化酶活性的测定
植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等。它们普遍存在于植物的各种组织中,可以通过催化植物体内的活性氧,防止发生氧化反应。所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系,经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
超氧化物岐化酶活性测定
超氧物歧化酶(SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基()的酶,它催化下列反应:

2

反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系,故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。后者在560nm处有最大吸收,而SOD可清除从而抑制了甲的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半(50%)时所需的酶量,据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】
高速台式离心机;分光光度计;微量进样器;荧光灯(反应试管处光照强度为4000lx);试管数支;黑色硬纸套。
【试剂】
()。
(内含1%聚乙烯吡咯烷***)。
(Met)溶液: 9g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
(NBT)溶液: NBT用磷酸缓冲液定容至100ml,现配先用,避光保存。
EDTA-Na2溶液: EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1 000ml。
: 000ml避光保存。
【材料与方法】
:取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉),加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,倒入5ml离心管中,用提取介质冲洗研钵2~3次,最后加缓冲液使终体积为5ml。于10 000r/min下离心10min,上清液即为SOD粗提液。
:取试管(要求透明度好)7支,3支为样品测定管,3支为对照管,另外1支作为空白,按表1加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处,其他各管于4000lx日光灯下反应20min(要求各管受光情况一致,反应室的温度高时时间可适当缩短,温度低时时间可适当延长;温度范围30-37度)。
【结果处理】
SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的作空白,分别测定其他各管560nm波长下的吸光度值,已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性:

SOD总活性(U·g-1FW)=
式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;
A0—照光对照管的吸光度值;
AS—样品管的吸光度值;
VT—样液总体积(ml);
V1—测定时样品用量(ml);
FW—样重(g);
表1-1 各溶液加入量
试剂(酶)
测定管用量(ml)
空白和对照管用量(ml)

130mmol/L Met溶液
750μmol/L NBT溶液
100μmol/L EDTA-Na2液
20μmol/L核黄素
酶液
蒸馏水
总体积

 
 
【注意事项】
1. 显色反应过程中要随时观察光下对照管的颜色变化,-。
2. 当光下对照管反应颜色达到要求的程度时,测定管(加酶液)未显色或颜色过淡,说明酶对NBT的光还原抑制作用过强,应对酶液进行适当稀释后再显色,以能抑制显色反应的50%为最佳。
3. 植物组织中的酚类物质对测定干扰,对酚类含量高的材料提取酶液时刻加入聚乙烯吡咯烷***(PVPP)消除之
【思考题】
?
?应如何克服?
二、过氧化氢酶活性的测定(采用滴定法)
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)