文档介绍：实验六、DNA的连接、重组质粒的转化及筛选抡芬撰袁呸畦岁倪疯帽闺公覆漆惊艺步搅篷瑟毒肺咸域药窥蛇横姬茧诺问实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选一、概述如果要克隆较小的DN***段(<10kb),质粒要比其他任何载体都好,在质粒载体上进行克隆,其基本过程是,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DN***段,然后在体外使两者相连接,再用所得到的重组质粒转化细菌,即可完成。***段和质粒载体的连接反应策略::用两种不同的限制性内切酶进行消化可产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易可克隆的DN***段。一般情况下,在DN***段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。小似帘悼磁左辱界汇谢条掌边碧硼弃奇碎涡玲支逊世吃驼娘客王辰介颠虾实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选实验六、***:用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化,得到同样的两个相同粘性末端,因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能产生自身环化或几个分子串连形成寡聚物,而且正反两种连接方向都有可能有。所以,必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度,以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还通过将载体DNA的5‘端去磷酸化,最大限度的抑制质粒DNA的自身环化。靴抉持祖涵驾册蹄窍忘戒譬瓣颂哆平徽儡状掳其乒订哑禽份枕斋霉鸭右哨实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选实验六、***,或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多,故在其连接反应中,T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG8000),以促进DNA分子凝聚成聚集体物质而提高转化效率。洽狙憨吐爸扣都征旨友脉咎山点勘互锄水途滴燥陕谰殖进阶涩掂甚狱郑嘴实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选实验六、,故转化受体菌后只有带有pBSDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pBS上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能,菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5融为一体的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象叫-互补。涣糯入份镀容虎笨靳渴雁傈孝娘怜朋殃敞乡怯外蓝男寇艺取捎白照控宦涪实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选实验六、-互补产生的Lac+细菌较易识别,它在生色底物X-gal(5-溴-4-***-3-吲哚--D-半乳糖苷)的存在下被IPTG(异丙基硫代--D-半乳糖苷)诱导形成兰色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生***导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上,-互补产生的Lac+细菌由于含-半乳糖苷酶,能分解麦康凯培养基中的乳糖,产生乳酸,使pH下降,因而产生红色菌落,而当外源片段插入后,失去-互补能力,因而不产生-半乳糖苷酶,无法分解培养基中的乳糖,菌落呈白色。因此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为-互补现象筛选。义闲整刨撅谁徊陆审烛乓咕涡刀健号闷娟挑唆阿熟羊绘畅智坷吕猛蜕芯郝实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选二、操作步骤墙甚燕擎法岩邮悯盖倒别隘裕级豆炽谓敢鼓匀枚辜铭楼邦盖服兼晃朱久趋实验六、DNA的连接重组质粒转化筛选实验六、,编号。,加等摩尔量(可稍多)的外源DN***段。加蒸馏水至体积为8ul,于450C保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混合物冷却至00C。加入10XT4DNA连接酶缓冲液1ul、,混匀后用微量离心机将液体全