文档介绍：分子生物学研究方法Date1分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展,其主要的原因之一是现代分子生物学研究方法,特别是基因操作和基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。一、重组DNA技术Date240年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制,解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说,并成功地破译了遗传密码,从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。1重组DNA技术诞生的理论基础Date32关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基1)DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现,才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2),大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后,便能吸收λ噬菌体的DNA。,经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立,对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3)Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应Date4重组DNA技术(binantDNAtechnique):是按照人们意愿,在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得该DNA的大量拷贝。3重组DNA技术的概念Date54重组DNA技术的基本步骤1)四大要素①外源基因②载体③工具酶④受体细胞Date62)重组DNA技术的基本步骤①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化Date7重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因(外源基因)基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装,转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交Date85重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制,从而拓宽了分子生物学的研究领域,这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。Date9酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸,补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列,根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团6重组DNA实验中常见的主要工具酶Date10