屋尘螨变应原基因Der p1的克隆、表达、纯化.pdf

文档介绍：屋尘螨变应原基因 Der p1 的克隆、表达、纯化
生命科学学院生物技术专业肖勇
学号:2002302015
【摘要】目的构建屋尘螨主要变应原 Der p1 的重组质粒,以此建立 Der pI 的原核表达体系;
并建立起表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物。方法参考 gene bank Der p 1 序列设计特
异性引物,通过 PCR 获得 Der p 1 基因片段的扩增,然后经 Nde I 和 Xho I 双酶切后和经过同样双
酶切的 pET-28a(+)质粒连接构建 Der p1/pET-28a(+)重组质粒,然后将其转化 BL-21star 高效
表达菌,诱导 Der p1/pET-28a(+)/BL-21 重组克隆菌大量表达,收获菌体经冻融、超声破菌后离
心获得融合表达的重组蛋白包涵体,并使用 Ni2+亲和层析柱进行亲和层析纯化蛋白质,用梯度透析
的方法进行变复性,然后分装冷冻真空干燥获得纯的 Der p1 表达蛋白。结果 Der p 1 基因片段
和 pET-28a(+)质粒酶切后连接获得了 Der p 1/pET-28a(+)重组质粒,转化后获得了 Der p 1/pET-28a
(+)/BL-21 的阳性菌落;挑取阳性菌落扩大培养,经 IPTG 诱导过夜获得大量表达的 Der p 1
包涵体蛋白;提取包涵体蛋白亲和层析时梯度洗脱可有效去除重组蛋白包涵体混淀中混杂的多数杂
蛋白成分,获得高纯度重组变应原 Der p1 蛋白。结论构建的 Der p 1/pET-28a(+)/BL-21 重组
克隆菌经诱导可大量表达 Der p 1 重组蛋白;粗提的 Der p 1 蛋白经 Ni2+亲和层析纯化后具有很高
的纯度,从而为后续的 Der p 1 蛋白免疫原性的研究打好了基础。
【关键词】屋尘螨;变应原;Der p 1;PCR;表达;纯化;重组蛋白
【教师点评】该论文通过构建屋尘螨 1 类变应原的重组质粒,建立了 Der p 1 的原核表达体系,
并建立起表达产物的标准纯化方法,获得理想的目的蛋白。该研究参考 Gene bank 中 Der p 1 序列
自行设计特异性引物,通过 PCR 扩增成功获得目的基因片断,测序验证无误后与表达载体连接。诱
导表达后通过重组 der p 1 蛋白表达形式的 SDS-PAGE 分析证明随着时间的增加,重组蛋白转为难溶
的包涵体形式存在,通过 Ni2+亲和层析纯化与梯度透析复性后,获得具有免疫活性的 Der p 1 重组
蛋白。该论文选题立意明确,科研设计合理,在掌握常规的分子生物学技术的基础上,加强了信息
生物学技术和生物学软件的应用,对 Der p 1 蛋白的一级结构和实验结果进行了较好的阐述,反映
出较高的学术水平。
点评教师:刘志刚教授
Molecular cloning、expression and Purification of the
binant Allergen Der p1 from Dermatophagoides
pteronyssinus.
【Abstract】 Objective To establish a binant plasmid of the main Allergen Der p1 from
Dermatophagoides pteronyssinus ,in order to build the prokaryotic expression system of Der p1; and then
to establish a purification procedure for the binant protein of Dermatophagoides pteronyssinus
expressed in Escherichia coli and obtain this ideal protein. Methods Rferrence to the Der p I sequence
from gene bank and design its particular primers to obtain the multiplication of Der p I fragments. Along
with the vector pET-28a , they were cut by the restrictive enzymes--Nde I and XhoI ; then they are linked
together after ligation reaction and form the Der p1/pET-28a(+)bin