文档介绍：毛柄金线菌 SRPK1 基因的分离鉴定

(理学院,应用化学系,应用化学专业(食品科学方向) 张二辉)
(学号:2000141012)

摘要:用免疫印迹技术检测到大型真菌毛柄金线菌中可能含有 SR 蛋白特异性激酶
1(SRPK1)。利用聚合酶链式反应(PCR)技术对毛柄金线菌 SRPK1 基因片段进行分离,
将该片段重组进 PMD 18-T Vector 中,并进行测序分析。实验结果表明:以毛柄金线菌总
mRNA 为模板,用合成的目的基因片段的简并序列为引物,获得了一含有一个内含子的不
可编码非完整蛋白的基因片段,该片段与其它动物和植物来源的 SRPK1 有 58%同源性,经
分析该片段可能是毛柄金线菌的 SRPK1 基因片段。
关键词:毛柄金线菌,SRPK1,聚合酶链式反应(PCR),重组,剪接
教师点评:本研究是刑苗教授主持的广东省自然科学基金项目的一部分。有关 SR 蛋白
激酶的研究的相关报道不多。除裂殖酵母外,再在其他的真菌中暂时未发现 SRPK1。课题
的难度很大。张二辉同学在老师的指导下,利用 RT-PCR 及 PCR 技术,在毛柄金线菌
(Flammuliina velutipes)中找到 SRPK1 类似激酶的基因片断。并利用 DNA 重组技术,得
到重组质粒,得到该片断的相关序列。该论文结果准确、详实,有相当的科学价值。(点评
老师:郑宗坤,副教授)
前言
1977 年,当美国麻省理工学院的 Phjllip Sharp 和冷泉港实验室的 Richard Roberts 分别领
导的两个研究小组在研究腺病毒(adenovirus)和其 mRNA 之间的杂种分子发现了基因割裂
(split)现象,一个新的称为 RNA 剪接 Splicing 的研究领域就从此诞生了[1]。
RNA 剪接研究中重大的发现之一是选择性剪接(alternative splicing),即在同—个基因
中,其剪接位点和形式可以改变,从而导致一个基因能产生多个具有明显差异的蛋白产物[2]。
选择性剪接是如何进行的呢?从 1990 年开始,一组称为 SR-蛋白的发现燃起了这一研究
的热点。第一个被找到的 SR-蛋白是 SF 2/ASF,它是在分析组成性(constitutive)剪接和
选择性剪接中发现的。迄今巳发现并克隆了这个蛋白家族的 8 个成员,它们是 SF 2/ASF,
SC 35,SRp 20,SRp 55,U2AF 70K 以及 tra 和 su 等。这个蛋白家族成员的氨基酸
顾序具有两个共同的特征:(1)具有一个或多个 RNA 识别结构(RNA recognition motif,简
1
称 RRM);(2)都含有一个或多个富含 SR(S—丝氨酸,R—精氨酸)二肽重复序列的区段。
SR-蛋白就是因其含有 SR 区段而得名。
SR-蛋白是剪接的基本要素。缺少 SR-蛋白无剪接活性的细胞组分中,加入 SR-蛋白可
恢复剪接活性。它们在将 mRNA 前体组装进剪接体的起始阶段起了至关重要的作用。在体
外剪接反应分析时,SR-蛋白具有类似的功用,也就是说,SR-蛋白家族的任何成员都能使
缺少 SR-蛋白无剪接活性的细胞提取液恢复剪接功能。
体外剪接研究表明,SR-蛋白通过蛋白与蛋白以及蛋白与 RNA 间的相互合作可导致
RNA 剪接的功能完成。SR-蛋白是剪接体组装和 RNA 剪接的关键因子,特别是在剪接体形
成的早期阶段,其作用更为显著,且这种功能作用很可能是通过蛋白间 SR 区段的相互作用
而实现的。因此,揭示 SR-蛋白中 SR 区段的功能作用及其调控机制巳开始成为 RNA 剪接
研究中的主要热点之一[1]。
在 1992 至 1994 年间,桂建芳等在美国加州大学圣迭戈校区(University of Califonia,
San Diego,UCSD)付向东(Xiang—DongFu)教授实验室从事博后和访问研究时,鉴定出
一个特异于 RNA 剪接因子 SR-蛋白、并将 RNA 剪接和细胞周期调控联系起来的激酶
(SRPK1)[5,6]。
由于 SR-蛋白中含有类似于 p34cdc2 激酶磷酸化底物的共有序列,开始时,桂等认为 SR-
蛋白可能也是 p34cdc2 激酶的磷酸化底物。为了验证上述设想,他们在获得了同步的有丝分
裂中期细胞和间期细胞并制备出有丝分裂中期细胞提取液和间期细胞提取液的基础上,首先
比较分析了有丝分裂中期细胞提取液和间期细胞提取液中 p34cdc2 激酶的活性差异,确证有
丝分裂中期细胞提取液中 p34cdc2 激酶的活性要比间期细胞提取液中高得多;接着采