实验三质粒DNA的酶切鉴定 ppt课件.ppt

文档介绍：分子生物学实验Experimentsofmolecularbiology授课教师:田生礼实验三质粒DNA的酶切鉴定*PPT课件实验三质粒DNA的酶切鉴定【目的要求】;,载体与供体进行酶切;;【实验原理】限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,共有I型、、II型、III型三类,II型限制性内切酶识别含4-8个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列,并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链,产生平齐末端和带单链突出端(粘性末端)的DNA片断,常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内切酶都不常用。*PPT课件【实验器材】台式离心机、振荡器,恒温水浴,微量移液器(20uL,200uL1000uL),。【实验材料】限制性内切酶(BamHI和XhoI)及酶切缓冲液、无菌水,质粒DNA溶液。【实验内容】:,电泳鉴定。:37度水浴1个小时*PPT课件酶切电泳图M:DL5,000DNAMarker;1:质粒DNA;2单酶切质粒DNA(BamHI);3:双酶切质粒DNA(BamHI和XhoI)。*PPT课件影响限制性内切酶的因素很多,酶反应条件是实验成功的重要因素,其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。酶切反应体系的组成:DNA量→酶量(最多占总体积的1/10)→总体积,即根据所用DNA的量确定用酶量,再根据用的酶量确定总体积。。酶切时加样顺序一般应为:水+缓冲液+DNA+酶,以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀,最后加酶混匀,离心后保温酶切。*PPT课件I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列,但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置,有的酶可在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割。l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列,其酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处,可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即,回文结构,通常为4-8bp,在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。限制性内切酶分类*PPT课件限制酶特点:-8个相连的核苷酸,以6个多见;限制性内切酶的识别序列BamHI5’-G-3’3’-CCTAGG-5’NotI5’-GCGC-3’3’-GGCG-5’(palindrome);;EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’,也有例外。FokI5’-GGATGNN-3’3’-CCTACNN-5’外侧,产生3’-,少数有变动,序列中的核苷酸被甲基化后,不能被切割。*PPT课件限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端*PPT课件同裂酶:能识别相同序列,切割位点可以相同也可以不同,来源不同的酶。(1)同裂酶(Isoschizomers)①完全同裂酶:识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。同列裂酶和同尾酶*PPT课件识别位点相同,但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶:*PPT课件