文档介绍:荧光定量PCR技术原理与结果分析
罗喜鹏
一、含义
二、优越性
三、应用
四、定量方法
五、荧光材料
六、结果分析
一、含义
实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
二、优越性
特异性荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性,故与传统的PCR相比,特异性大为提高。
敏感性荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml,对数期分析,线性范围很宽,为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝,在此范围内荧光定量PCR定量较为准确,标本不需稀释。
重复性荧光定量PCR结果相当稳定,,各反应组分浓度相对稳定,没有副作用,CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定,更精确地反映起始模板的拷贝数。
自动化无PCR后续操作步骤,降低产物污染的风险性。
三、应用
用于核酸的定量如RNA、DNA的定量
用于核酸定性分析如SNP分析,基因型分析,RNA变异分析,溶解曲线分析等。
四、定量方法
1.   标准曲线法的绝对定量
2.   标准曲线法的相对定量 
3.   比较CT法的相对定量
五、荧光材料
荧光探针和荧光染料
◇ SYBR green I
◇  水解探针TaqMan
◇  分子信标
◇  杂交探针
SYBR green I
未结合的SYBR green I
水解探针TaqMan
荧光素
淬灭剂
与目标序列互补
FAM
TET
JOE
HEX
VIC
TAMRA
DABCYL
探针与目标序列配对时,发生荧光共振能量转移(FRET)
光
能量转移
Taq
游离的探针
荧光基团
淬灭剂
延伸时,Taq酶水解探针,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光,形成荧光信号
Taq
发出荧光
光
另一波长的荧光