文档介绍：实验一:双缩腺法测定蛋白质含量一目的掌握双缩腺法测定蛋白质含量的原理及方法。二原理双缩腺( )是两分子尿素经180°C左右加热,放岀一分子氨(NHJ后得到的产物。在强碱溶液屮,双缩麻与CUSO,形成紫色络合物,称为双缩麻反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩腺反应。蛋白质含有多个肽键,在碱性溶液中能与络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比,而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关,故可用來测定蛋白质含量。该法対样品中蛋白质含量要求相对较高,一般在1—lOmg/L蛋白质。tris(三甲耗基氨基甲烷)、一些氨基酸、EDTA(乙二***四乙酸)、草二酰***、多肽等会于扰该测定。在一定浓度范围内,反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系,即蛋白质浓度越高,体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰(吸光度)。将未知浓度的样品溶液与一系列己知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩服试剂反应,并在540nm处比色,可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线,求得未知样品中的蛋白质含量(浓度)。由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好,故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。三仪器与器材可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机(器)、漏斗、试管架、具塞三角瓶(100ml)容量瓶(250ml、500ml、1000ml)、刻度吸管()试管()。四试剂1、 双缩聯试剂称取硫酸铜(CUSO4-5H2O),酒石酸钾钠( ),分别用250ml蒸僧水溶解后,一并转入1000m1容量瓶中,在搅拌下(可用旋涡混合器或摇动)加入30mll0%(质量分数)NaOH溶液,然后用蒸懈水稀释至刻度(1000ml)。将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存(须无红色或黑色沉淀出现),长期使用。2、 (需标定)。3、 (干酪素),并定容于100ml,即为5mg/L的标准溶液。4、 未知蛋白质溶液浓度应在1—10mg/L范I詞内。可根据条件选用小麦粉或家畜血清,后者需用水稀释10倍,置于冰箱保存备用。五方法与步骤1、标准曲线的绘制取12支试管分两组,、、、、、,、、、、、、,,最后分别加入4ml双缩脉试剂。充分摇匀后,室温下(20—25°C)放置30min,于540nm处进行比色测定,用未加蛋白质溶液的第-支试管作为空白对照液,并取两组测定的平均值。以蛋白质的含量作为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线绘制操作表见下。(共12支管,分两组,只列岀一组。)试剂每组编号123456标准蛋白质溶液(ml)(ml)(ml)(mg)、 样品测定(1) 小麦样品的制备与测定 ①将磨碎过100目筛的小麦样品在80°C