基因工程报告解析.ppt

文档介绍：抑制性消减杂交技术suppressionsubtractivehybridization报告人:王佳宁杨广磊*背景*高等真核生物细胞中约含有4一10万个不同的基因,但在生物体的发育过程中只有巧15%:个体的发育和分化、体内稳态的维持、细胞周期的调控、衰老、,就必须将这些差异表达的基因分离、鉴定并作深人研究,为此人们建立了一系列研究基因表达差异的方法.**al在进一步完善差异显示逆转录PCR基础上发展了代表性差异分析法(RDA)1994年Hubanketal将RDA技术改良,设计了cDNA-RDA方法,该方法用于比较具有相近遗传背景、表型不同的两组cDNA之间的差异1996年Diachenkoetal在RDA的基础上发展了抑制性消减杂交技术背景*原理*抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR反应为基础,将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。通过合成两个不同的接头,接于经限制性内切酶消化后的测试cDN***段的5’末端,将测试和驱动进行两轮杂交。所谓抑制性PCR是利用链内退火优于链间退火,使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构,无法与引物配对,从而选择性抑制非目的序列片段扩增。*实验流程*由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐**TestercDNA+Adaptor1TestercDNA+Adaptor2RcDNA末端接头连接:将测试cDNA分为两份,每份连接不同的接头,即接头1(adaptor1)和接头2(adaptor2)实验流程**DrivercDNA(过量)ABCDABCDTestercDNAwithAdaptor1TestercDNAwithAdaptor2R第一次消减杂交实验流程**ABCDTester杂交液(Adaptor1)ABCDTester杂交液(Adaptor2R)DrivercDNA(加热变性)A,B,C,DE第二次消减杂交实验流程**A,B,C,D末端补齐EABCDEE末端补齐实验流程**ABCDE加入共用PCR引物EA,D:不能被扩增C:线性扩增B:扩增受到抑制E5’3’3’5’E第一次PCR扩增实验流程