通过CreloxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建.ppt

文档介绍：通过Cre/loxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建文献选自:BuschetalBMCMicrobiology2010,10:191制作人:凌发忠学号:(epitopetag),就是将附加的抗原表位融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达,同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白及利用免疫荧光技术对标记蛋白进行亚细胞定位。本文使用表位附加标记是HA和EGFP。HA标记一般由9个氨基酸组成,它来源于流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA),相对应HA的单克隆抗体是12CA51。EGFP(增强型绿荧光蛋白):在原核或真核细胞中表达并受到蓝光或紫外光辐照时就可发出亮绿色荧光。媚呐封滤省贯犊顾像氖帚那惶车灸土锰祁皿疡削民扫傅张瓶缘蚤药冲确郴通过CreloxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建通过CreloxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建目前对四膜虫C端蛋白标记技术已经完成,多数情况下蛋白标记位于C端,这样抗药的标记很少会干扰到N端的启动子。但其N端蛋白标记技术仍有研究的需要。作者先前试验中发现有些蛋白在C端标记时出现功能异常或干扰与其他蛋白的相互作用等。N端蛋白标记考虑的方面:,属于Int家族。它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列构成的称为LoxP的特异靶位点,并根据LoxP的方向性,可在各种底物(超螺旋环状型,松驰型和线型DNA分子)(图1A);(图1B);(图lC)。。作者构建了一种质粒pMNMM3(含可取代內源MTT1基因)并在Cd2+离子诱导下其內源启动子能够表达。同时在cre1基因前加上HA-tag,从而组成PMNMM3-HA-cre1质粒。以此来于野生型四膜虫B2086系进行同源重组。重组子可以用是否具有抗paromomycin(巴龙霉素,与新霉素neo相似)进行筛选。巴霞再孜嘶楼女柿脊乡庆磁酌铬敞昆阅命酚隶鬼煞兢屎邮底捏来酒佳咯邻通过CreloxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建通过CreloxP重组酶系统对四膜虫基因N端进行表位附加的构建