实时荧光定量PCR.ppt

文档介绍：实时荧光定量PCR卢瑶瑶、黄志聪佘碧芳、李家威实时荧光定量PCR技术研究概述问题诞生方法应用原理诞生实时荧光定量PCR(real-timefluorescencequantitativePolymeraseChainReaction,RTFQPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量试验技术,即通常所说RT-PCR技术。原理1、非探针类(SYBRGreenI法)SYBRGreenI是一种结合于双链DNA结合染料。与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2、探针类(TaqMan探针法)方法荧光定量PCR方法的确定目的基因的查找和比对引物、、探针的设计按荧光产生的原理有两种方法:荧光探针法和荧光染料法。染料法利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。与常规PCR类似,唯一区别是在反应体系中加入了SYBRGreen染料分子。探针法:与常规PCR的不同之处在于:在上下游引物外还加入了让具有序列特异性的探针(探针本身具有荧光标记),该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合,与染料法相比,提高了实验的特异性。目前市场上探针多样,其中以TaqMan探针应用最为广泛。荧光素:FAM、Texasred、LC-Red640,LC-Red705等1、荧光定量PCR方法和荧光标记素的选择与确定2、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比对●。●通过BLAST对该目的基因进行对比,找出保守序列。3、引物的设计与合成:、探针的设计与合成:DNAstar软件中的Seqman软件选择高品质的引物探针合成商。5、标准品的制备(1)选择一个已知起始拷贝数(起始模板数)的样品(2)反应体系的配置(3)反应条件的设置(4)反应体系与条件的优化*(1)、反应体系的配置