文档介绍：基因枪介导的pSilencercJun载体对大鼠结肠组织的RNA干扰效应
作者:库热西·玉努斯,韩明国,郭霞,龙梅,贺捷,袁武梅,哈木拉提·吾甫尔
【关键词】 RNA干扰,基因枪,cJun,基因治疗
0 引言
RNAi要进入实际应用,迫切需要解决的问题是如何研制有效的给药系统将siRNA分子准确传送到靶组织. 基因枪技术已经在肿瘤基因疫苗研制方面得到了应用,并且成功地介导特异siRNA抑制肿瘤细胞生长[1]. 从而为联合应用RNAi干扰和基因枪技术对以cjun为靶点的基因治疗的实现提供了实验依据. 前期研究中pSilencercjun载体在COS7细胞中显示良好的基因沉默效率,我们将基因枪技术与RNAi技术结合起来,直接运用基因枪轰击大鼠结肠组织,将RNAi实验运用于活体组织,验证基因枪介导的活体动物基因沉默.
1 材料和方法
材料
体质量200~250 g ,pSilencer载体购自Ambion, cJun, βactin抗体购自Santa cruz公司,二抗购自北京中杉金桥生物公司.
方法
基因枪及子弹制备SJ500手提基因枪购自宁波新芝公司,金粉由宁波新芝公司馈赠,子弹制备按亚精胺
CaCl2包被法.

动物实验
大鼠手术开腹,选择其自肛门5~8 cm段结肠,按操作说明书用基因枪轰击大鼠cjun基因特异性pSilencer质粒, h后脱颈椎处死,剪取相应结肠组织.
Western Blot检测
大鼠结肠组织c g,剪碎加入细胞裂解液,匀浆裂解40 min ,12000 g/min离心5 min,收集上清液进行蛋白定量(考马斯亮蓝法). 变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移,丽春红S染色,封闭非特异性的结合位点,TBST洗膜,然后加入抗cJun的mAb(1∶200)孵育2 h. TBST洗膜后加入结合有辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔的IgG二抗(1∶4000)孵育2 h.. 化学发光、显影、定影,βactin蛋白作为内参照.
2 结果
Western Blot显示内参照βactin蛋白表达没有差异,pSilencercjun载体干预时cJun蛋白表达明显减少,载体剂量为9 μg以上时基本完全被抑制.
3 讨论
cJun蛋白可与原癌基因Fos家族的产物Fos蛋白形成异源二聚体—激活蛋白1(AP1). 且与其结合位点(佛波酯反应元件,TRE)特异序