Akt激活HIF-1α表达抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡.doc

文档介绍：红景天苷通过PI(3)K/Akt激活HIF-1α表达抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:张金平, 陈建宗*, 刘安恒, 司瑞, 胡玉珍, 贾新, 张娟, 蒋蔚峰
【摘要】目的: 探讨红景天苷激活HIF-1α表达, 抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡的可能的信号通路。方法: 将原代培养的心肌细胞分为4组: 正常对照组、缺氧组、缺氧+100 mg/L红景天苷组、缺氧+100 mg/L红景天苷+LY294002组。MTT法测定细胞存活率, Hoechst33258染色、 DNA-ladder检测细胞凋亡, 通过免疫荧光染色、 Western blot检测细胞Akt、磷酸化Akt、 HIF-1α的表达。结果: LY294002处理后, 红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用被明显减弱, 细胞存活率明显下降(), 细胞凋亡比率明显增加(), 琼脂糖凝胶电泳特异性“ladder”灰度明显加深, 磷酸化Akt、 HIF-1α 2种蛋白表达水平明显降低。结论: 红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用, 其机制可能是通过PI(3)K/Akt信号通路激活HIF-1α的表达有关。
【关键词】红景天苷心肌细胞 PI(3)K/Akt HIF-1α
大量实验证实, 缺氧可诱导心肌细胞凋亡, 造成心肌损伤,进而参与心力衰竭的发病过程[1]。红景天苷(salidroside, Sal)为传统中药红景天的有效萃取物之一。近年研究表明,红景天苷具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老和抑制人脐静脉内皮细胞[2]等多种药理作用。通过前期实验, 我们已经证实红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡具有良好的抑制作用, 且这种抑制作用具有剂量依赖性, 并首次证实其分子机制可能与激活缺氧诱导因子-1
α(hypoxia induced factor-1α, HIF-1α)的表达, 诱导其转位有关。但其具体的信号通路, 至今仍不明确。本研究拟通过研究Akt变化, 进一步探讨红景天苷激活HIF-1α表达可能的信号通路。
1 材料和方法
材料红景天苷(纯度99%)购自中国药品生物制品鉴定所。新生牛血清、 DMEM低糖培养基购自Gibco公司。胶原酶I、噻唑蓝(MTT)、 5-溴-2′-脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)、 LY294002、 RNase A均购自Sigma公司。Hoechst 33258染料、 BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。蛋白酶K购自Merck。HIF-1α兔多克隆抗体购自美国Novus。Akt、磷酸化Akt抗体均购自CST。HRP、 FITC标记羊抗兔二抗均购自北京中山。其余试剂为国产分析纯级。
方法
心肌细胞原代培养取新生1~3 d SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)心室肌组织并剪碎, g/L的胶原酶I37
℃分次消化, 分离心肌细胞。以含100 mL/L新生牛血清的DMEM低糖培养基制备细胞悬液, 差速贴壁后加入100 μmol/L BrdU纯化心肌细胞, 使纯度达到90%以上, 接种细胞至培养板。
缺氧模型建立采用Koyama等[3]方法配制缺氧液(mmol/L): 、 、 、 MgSO4 、乳酸钠 40、 HEPES 20、 NaCl 、 KCl , , 37℃, 以高浓度氮气饱和(% 1 L/min×30 min), 测其血气PO2≤ kPa。用缺氧液置换正常培养液, 三气培养箱(Kendro, Germany), 调整气体浓度为950 mL/L N2+50 mL/L CO2, 孵育6 h。
实验分组将培养的心肌细胞分为4组: (1)正常对照组(Control): 用正常培养液培养细胞; (2)缺氧组(Hypoxia): 参照上述方法, 建立缺氧模型; (3)100 mg/L红景天苷预处理组(Hypoxia+Sal): 缺氧前, 100 mg/L红景天苷预处理24 h, 参照(2)行缺氧处理。(4)LY294002+红景天处理组(Hypoxia+Sal+LY): 100 mg/L红景天苷预处理24 h后继续用20 μmol/L LY294002处理1 h, 参照(2)行缺氧处理。
观察指标
细胞存活率 MTT比色法检测细胞存活率。细胞接种于96孔板, 缺氧处理后, 每孔加入5 g/L MTT 20 μL, CO2孵箱孵育4 h, 弃上清液, 每孔加入DMSO 150 μL,