文档介绍：IGF1R的真核表达和单克隆抗体的制备
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:张翠珍, 余君铭△, 周敏, 刘世国, 高慧萍, 田淑君, 李宗海
【摘要】目的: IGF1R稳定表达株的建立和抗IGF1R单克隆抗体(mAb)的制备。方法: 从cDNA扩增得到人全长IGF1R基因, 构建成含有ETag的质粒。用此质粒建立稳定表达IGF1R的细胞株, 并免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb。结果: 成功构建IGF1R病毒质粒, 并筛选得到稳定表达IGF1R的3T3细胞, 该细胞免疫BALB/c小鼠后筛选得到6株稳定分泌抗IGF1R抗体的杂交瘤细胞株, Western blot结果显示抗体8G3能特异性识别抗原。结论: 成功制备了IGF1R的mAb, 为进一步研究IGF1R在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具。
【关键词】 IGF1R; 真核表达; 杂交瘤; 单克隆抗体
胰岛素生长因子1受体(insulin growth factor I receptor, IGF1R)及其配体IGF在肿瘤发生和转移中的作用研究是近年来的热点。研究发现, IGF1通过IGF1R的介导, 可以在其他生长因子缺乏的情况下, 促使细胞增殖周期完成[1], IGF
1R在细胞表面的表达量和细胞阻止凋亡的能力成正比[2]。已经有很多研究表明, IGF1R与肿瘤的产生, 发展和转移密切相关[3, 4]。可见阻止IGF1R的生物学功能, 具有很大的临床应用前景。我们用真核表达的IGF1R作为抗原, 制备了特异性单克隆抗体(mAb), 为研究IGF1R在肿瘤治疗领域的应用提供了有力的工具。
1 材料和方法
材料质粒pWPXL、 PMD2G、、大肠杆菌Top10株, HEK 293T细胞系、 NIH HeLa细胞、 NIH 3T3细胞系以及Sp2/0细胞均由本室保存; 限制性内切酶BamH I、 EcoR I和Nde I均购自大连宝生物公司; 血液采自健康人; 胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。HRP山羊抗小鼠IgG是Sigma公司产品。抗ETag抗体是GE Healthcare产品。BALB/c小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供。
方法
细胞培养和传代 HEK 293T、 NIH HeLa和NIH 3T3细胞系培养条件为: 在37℃、 50 mL/L CO2的培养箱中, 用含有100 mL/L胎牛血清(NIH 3T3用小牛血清), 100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养液培养, g/L胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期, 生长状态良好的细胞用于实验。
人cDNA的制备取6 mL稀释血液(PBS等比稀释), 加入3 mL淋巴细胞分离液, 400 g, 室温离心20 min。取单个核细胞, 加入5倍PBS, 400 g, 室温离心10 min, 重复1次, 去上清, 加入1 mL TRIzol/106细胞, 室温静置5 min, 加200
μL***仿, 剧烈震荡1 min, 室温静置5 min, 12 000 g, 4℃