文档介绍：LHR真核表达载体构建及表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的构建黄体生成素受体(LHR)真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法 KpnⅠ/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体获得目的基因,(+)真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF7乳腺癌细胞,G418筛选,RTPCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHR MCF7细胞。(+)LHR酶切图谱分析结果、(+)LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RTPCR检测MCF7细胞LHR mRNA,MCF7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF7细胞高表达LHR。(+)LHR真核表达载体,在MCF7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。
【关键词】受体, LH; 绒毛膜促性腺激素; 乳腺肿瘤; 克隆细胞; 遗传载体; 基因表达RNA, 信使
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)是胚胎滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素,通过与黄体生成素受体(luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor,LHR)结合发挥生物作用[1]。近年的研究发现乳腺细胞存在hCG受体,因此有学者认为妊娠期hCG对乳腺细胞的直接作用可能与生育后妇女乳腺癌发生率降低相关[2
4]。笔者通过建立高表达LHR的乳腺癌细胞株,探讨hCG对乳腺癌细胞的直接作用,以提供实验细胞模型。
1 材料与方法
材料 MCF7乳腺癌细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。含LHRcDNA的质粒载体由美国Louisville大学Zhenmin Lei教授提供。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);DMEM培养基、G418、(+)、pEGFP、M2000、RNA Trizol(美国Invitrogen公司);限制性核酸内切酶ApaⅠ(美国Promega公司),限制性核酸内切酶KpnⅠ及NheⅠ(美国纽英轮生物技术有限公司);1Kb DNA ladder Marker、小抽质粒抽提试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司);大抽质粒抽提试剂盒Hispeed plasmid midi kit(25)(德国QIAGEN公司);RTPCR试剂(日本TaKaRa公司);cAMP EIA kit(美国Cayman公司);hCG(美国Sigma公司)。引物合成与测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
方法参照文献[56]。
(+)LHR重组质粒 KpnⅠ/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体、KpnⅠ/EcoR V (+)载体,琼脂糖电泳分离,胶回收纯化,(+)载体与LHR
cDNA片段连接,(+)LHR,具体操作步骤按说明书。按常规