文档介绍：Med19基因沉默对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:丁相福李俊安宋彬房学东
【摘要】目的研究Med19基因在胃癌MGC803细胞中沉默后对细胞增殖和周期的影响。方法应用shRNA慢病毒载体感染胃癌MGC803细胞沉默Med19基因,通过MTT和克隆形成实验观察Med19基因在胃癌细胞增殖中的作用,并用流式细胞术验证抑制Med19基因对细胞周期的影响。结果构建的shRNA慢病毒载体感染MGC803细胞后细胞增殖能力显著降低、细胞克隆形成能力明显减弱,同时,细胞周期阻滞于G1期。结论 Med19基因沉默后胃癌细胞的增殖能力和细胞周期均受到显著影响,提示Med19在肿瘤形成过程中具有重要作用。
【关键词】胃癌;Med19;RNAi;增殖;细胞周期
中介体(Mediator)最早发现于酵母菌中,是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子复合物,属于RNA 聚合酶Ⅱ通用转录装置的基本组分,在真核生物mRNA 合成的活化和抑制中发挥关键作用,对RNA聚合酶Ⅱ活力进行调节〔1~3〕。哺乳动物中介体的亚基组成及其相关活性已经确定,目前已鉴定30余种亚基,其中多数亚基与酵母的中介体亚基存在广泛的同源性〔4,5〕。Med19是中介体其中一个亚单位,又称为肺癌转移相关蛋白(lung cancer metastasis related protein l, LCMR1)。最初由高转移肺癌中克隆得到,已被证实参与细胞信号由胞外向胞内转导。抑制Med19基因,可引起某些调节细胞生长、细胞分化和凋亡的基因的表达发生改变,提示Med19可能参与细胞周期调控、信号转导或转录调控〔6〕。本研究利用慢病毒介导的RNAi方法在胃癌MGC
803细胞中沉默Med19基因,观察其影响细胞增殖和细胞周期的能力,从而对Med19基因在胃癌中的功能进行验证。
1 材料与方法
Med19基因shRNA 慢病毒载体的构建靶向Med19基因的siRNA序列3′AAGGTGAAGGAGAAGCTAAGT5′,由上海生工公司合成短发卡结构的双链DNA(shRNA),重组进入慢病毒质粒pLVTHM,转化大肠杆菌感受态细胞并挑选重组克隆进行菌落PCR鉴定,测序验证后的shRNA慢病毒载体大量扩增,与包装辅助质粒psPAX2、pMD2G共转染至病毒包装细胞293T,12 h后换液,转染72 h收集细胞上清,并裂解细胞,用微孔滤膜过滤除菌,超速离心后弃上清液,用冰PBS溶液重悬病毒沉淀,得到shRNA慢病毒包装颗粒,有限稀释法通过荧光观察标定病毒滴度。
慢病毒介导RNAi沉默Med19基因的效率验证 pLVTHMsiMed19载体包装的慢病毒颗粒感染胃癌MGC803细胞,72 h后荧光显微镜下观察GFP的表达情况,通过计算在白光下细胞总数与绿色荧光细胞的比值,得到GFP的阳性表达率,可知慢病毒对MGC
803细胞感染率达到85%以上。感染后的第5天抽提细胞总RNA,通过RTPCR法检测shRNA慢病毒对Med19 mRNA表达的抑制作用;同时裂解细胞收集总蛋白,Western印迹法验证Med19蛋白水平表达的变化,确认shRNA慢病毒对Med19基因的阻断效应。
MTT方法检测细胞增殖情况实验共分为三组:shRNA慢病毒感染组(shRNA组,靶向Med19基因的shRNA慢病毒)、非特异性的shRNA阴性对照病毒感染组(NC组,对照序列shRNA慢病毒)和空白对照组(C组,MGC803细胞未作任何处理)。取对数生长期细胞MGC803细胞接种于96孔板中,计数细胞每孔2 000个,每组5个复孔,接种5块复板。接种第2天加MTT(5 mg/ml)10 μl/孔,4 h后吸出培养基,加入DMSO 100 μl/孔。5 min后酶标仪检测OD570吸光度值,连续检测5 d。每天一块复板。根据MTT读值绘制细胞生长曲线。
细胞克隆形成实验实验分组同前,shRNA慢病毒感染后的MGC803细胞制备成细胞悬液,接种于6孔板,每孔200个细胞,将接种好的细胞于37℃、5% CO2培养箱中继续培养到绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止,中途进行数次换液并进行细胞状态观察,连续观察14 d。实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照,终止时用PBS溶液洗涤细胞2次,多聚甲醛固定细胞40 min,PBS溶液再次洗涤后用GIEMSA染色液对细胞染色10 min,去离子水清洗细胞3次去除背景,晾干、拍照和计数克隆。
流式细胞仪检测细胞周期实验分组同前,感染shRNA慢病毒的MGC
803细胞接种于6孔板中,细胞固定时先用胰酶