PTDp53 融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性.doc

文档介绍：PTDp53 融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:丁忠阳,蔡兵,穆会君,孙力,俞悦,高云
【摘要】目的:原核表达野生型p53与PTD的融合蛋白,检测 PTD介导p53进入肝癌细胞的效率。方法:利用RTPCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTATHA和pET 32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTDp53融合蛋白加入HepG2 细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测PTDp53融合蛋白导入HepG2 细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53 融合蛋白及p53蛋白,证实PTDp53可以高效地转入HepG2细胞。结论:PTDp53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTDp53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。
【关键词】 PTDp53融合蛋白;表达;纯化;肝癌
p53基因是目前研究最广泛最深入的抑癌基因,在细胞受到损害导致DNA断裂时,p53蛋白可使细胞分裂停滞在G1/S期; 如损伤不能修复,p53基因则启动细胞的程序性死亡过程而引发细胞凋亡;一旦p53基因缺失或突变失活,则将导致细胞恶性转化、无限制增殖从而引发癌症。因此如果将p53蛋白导入肿瘤细胞就能发挥有效的抗肿瘤作用。PTD(protein transduction domain)是一个富含碱性氨基酸残基的蛋白结构域,PTD 融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具[1]。为了探索将p53高效引入肿瘤细胞治疗肿瘤性疾病的新途径,我们制备了蛋白转导域Tat与p53 的融合蛋白。理论上TatPTD可以发挥高效的蛋白转导特性将p53导入肝癌细胞内,并且TatPTD上的核定位序列还可将p53引入细胞核,p53在细胞核内可以发挥其生物学活性,抑制肿瘤细胞生长[2]。
1 材料和方法
材料Trizol Reagent购自Invitrogen生物技术公司;RTPCR 试剂盒、限制性内切酶及连接酶为上海塔卡拉公司产品;核酸电泳低分子质量标准蛋白质和IPTG 均为华美公司产品;质粒小量提取试剂盒、质粒纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;NiNTA agarose PD10购自上海生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品;pTATHA 质粒由美国Dowdy公司提供; A549细胞株由南京医科大学生物化学与分子生物学教研室提供;大肠杆菌JM109 、BL21(DE3)LysS 由第三作者所在研究所保存;小鼠购买于上海实验动物中心,体重26~38 g;肝癌细胞株HepG2细胞由南京医科大学细胞生物学教研室提供。
方法
p53基因的克隆和原核表达载体构建 RTPCR引物由南京奥科生物技术有限公司合成,上游引物5′GCAGTCAG3′,下游引物5′TT3′。在50μl体系中进行一步法RTPCR,纯化的PCR产物以Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ双酶切,回收酶切产物。将质粒pTATHA和pET32a分别用KpnⅠ及EcoRⅠ双酶切,回收酶切产物。以T4 DNA连接酶将p53基因分别克隆入原核表达载体pTATHA和pET32a,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,以含Amp 的固体培养基(LB)筛选阳性克隆,小量提取质粒后,用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。测序由上海生工生物工程有限公司完成。
p53基因的克隆和表达载体的构建将(DE3)LysS接种于含Amp 的LB 培养液37 ℃振摇过夜,次日按1∶100 转种于2 L 新鲜的LB 培养液继续培养4 h,加入IPTG 至终浓度为1 mmol·L-1,继续培养4 h后离心收菌。以含8 mol·L-1尿素的裂解液进行裂解,冰浴中超声8×15 s,离心弃沉淀。将上清中加入1 ml NiNTA 琼脂糖,室温、150 r·min-1 吸附1 h。5 000 r·min-1 离心5 min 后弃上清,以20 mmol·L-1 咪唑洗涤沉淀。依次用100、200、500 mmol·L-1 咪唑溶液进行洗脱,收集洗脱液进行SDSPAGE 分析并凝胶扫描测定蛋白纯度,BCA法测定纯化蛋白的浓度。
Tatp53 融合蛋白的小量表达及鉴定以pTATHA/p53 原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS。挑取单克隆接种于3 ml含Amp 的LB 培养液37 ℃振摇过夜,1∶100 接种于新鲜LB 培养液振摇培养4 h,加入IPT