文档介绍：RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:孙海波李静安鼎伟陈丽张照果
【摘要】目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响。方法采用真核细胞转染技术将pSilencer H1siRNASTAT3重组质粒转染人结肠癌HCT116细胞,MTT法检测细胞增殖,RTPCR、Western blot及免疫组化法分别观察STAT3基因和蛋白的变化,流式细胞仪及AO/EB染色观察细胞凋亡。结果 pSilencer H1siRNASTAT3重组质粒对大肠癌细胞的增殖有明显抑制作用,与空白组及阴性组相比差异有统计学意义();在重组质粒组,STAT3基因mRNA及蛋白的表达与空白组及阴性组相比明显减低();重组质粒可诱导HCT116细胞凋亡,细胞周期分期示细胞阻滞于G2期。结论 pSilencer H1siRNASTAT3重组质粒可抑制STAT3基因在人大肠癌细胞中的表达。
【关键词】 STAT3;RNA干扰;大肠癌;基因治疗
大肠癌发生发展过程受诸多因素的影响〔1〕。传统的放疗、化疗及手术治疗仍不能获得理想的效果,而基因治疗逐渐成为大肠癌研究的热点。转录信号传导子与激活子家族(signal transducers and activators of transcription,STAT)的重要成员STAT3,其信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关,该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化,目前将其定义为癌基因〔2〕。本文通过RNA干扰(RNAi)技术抑制STAT3基因在人大肠癌细胞HCT116中的表达,观察其对大肠癌细胞生物学行为的影响,为大肠癌基因治疗提供有效靶点及技术。
1 材料与方法
材料 Anti
pSTAT3(Y705)、βactin兔抗人多克隆抗体购自cst公司。人结肠癌HCT116细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。转染试剂siPORT NeoFX购于Ambion公司,IMDM、胎牛血清购自Gibco公司,常规试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。U6STAT3siRNAGFP重组质粒由本室保存,超纯质粒小样快速提取试剂盒(去内毒素)购于EZNA公司,质粒提取按说明书进行, g/L者待用。
方法
MTT法取对数生长期细胞,转染前1 h,%胰酶消化后,含10%胎牛血清的IMEM培养基终止消化,收集备用。实验分为空白组(M),pSH1SiScramble组(N),pSH1SiSTAT3组(T),T组再按质粒浓度分为T1、T2、T3。每组分24 h、48 h、72 h三个时间段,每时间段 4复孔。各组质粒分别取: μg,
μg, μg, μl,于24 h、48 h、72 h相差显微镜下观察拍照后,各孔加入5 g/L的MTT 20 μl,孵育4 h,弃上清,每孔加入分析纯DMSO 100 μl,震荡10 min,酶标仪检测各孔