文档介绍：RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖、凋亡的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的研究构建的ABCE1基因SiRNA表达质粒基因沉默效果,及其对95D肺癌细胞株增殖、凋亡能力的影响。方法运用转染试剂FuGENE 6对3种不同的ABCE1基因SiRNA表达质粒在95D肺癌细胞中进行转染,并用G418筛选,荧光显微镜观察3种质粒的转染效果,收集转染细胞,计数转染细胞总数、运用MTT法检测细胞活力,用ELISA法检测细胞凋亡。结果①转染的细胞表达红色荧光蛋白,荧光显微镜结果表明,%。②实验组的细胞增殖低于对照组、而细胞凋亡高于对照组(P<)。结论 ABCE1特异性siRNA可明显抑制ABCE1基因转录和表达,并能有效诱导95D细胞的凋亡,为下一步在体内利用Si1重组质粒沉寂ABCE1基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础。
【关键词】 SiRNA;ABCE1基因;转染
第一作者:郑毛根(1966),男,博士,副主任医师,主要研究肺癌的早期诊断与治疗。ABCE1基因是保守的ABC基因家族中最保守的基因之一,Chen等最近报道,ABCE1基因在脊椎动物的翻译起始中起重要作用,而翻译作为肿瘤的发生、发展过程中起相当重要的作用〔1〕。近期发展起来的RNA干扰技术具有几乎无细胞毒性、稳定性强、高效特异抑制靶基因等特点,为特异地抑制目的基因表达提供了有效的方法。本实验拟利用ABCE1特异性SiRNA表达载体转染肺癌细胞系95
D,评价其对95D细胞生长的抑制作用,并评价其对增殖、凋亡相关信号转导通路表达的影响,推测ABCE1基因对肺癌细胞95D的转移、浸润能力,为利用研究ABCE1与肺癌转移的相关性提供实验依据。
1 材料与方法
材料
人肺腺癌细胞株95D购自中科院上海细胞所。3种ABCE1基因的SiRNA质粒(Si1,Si2,SiN)均为本课题组前期实验所构建。1640培养基、10%胎生小牛血清购于Hyclone公司。G418 (GibcoBRL)购自北京中山生物工程公司;转染试剂FUGENE6 和ELISA 试剂盒购自Roche公司(USA),MTT 购自Sigma 公司(USA)。细胞培养板6孔板、24孔板、96孔板购自北京中山生物技术有限公司。
方法
NSCLC细胞株培养
冻存细胞95D经复苏后,37℃、5%CO2条件下培养于含有10%胎牛血清的1640培养基(含浓度为100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素中,待80~90%细胞融合后胰酶消化传代。经3次传代稳定后,进行如下实验。
G418筛选浓度确定
在12孔细胞培养板中,95
D细胞,×105/孔细胞接种,加10%FBS的1640培养基1 ml培养,至细胞密度达到80%~90%左右,分别加入G418(新霉素),使G418筛选浓度依次为将每孔中的G418浓度稀释至50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1 100 μg/ml等12个级别,培养10~14 d。每3天换液1次,维持培养孔中G418筛选浓度不变,显微镜观察细胞的生长状况,以第8~14天能杀死孔内所有细胞的G418浓度确定为筛选浓度。
细胞分组及转染
将对数生长的细胞按2 ×103浓度接种到6孔培养板中培养。于30%~50%细胞汇合度时(处于对数生长期)准备进行转染。实验分为4组,分别为质粒Si1转染组、质粒Si2转染组、阴性序列转染组(质粒SiN组)及空白对照组(正常细胞N组)。转染按Roche公司非脂质体型转染试剂FuGENE6说明书操作。前3组内质粒与FuGENE6采用1∶6比例。48 h后用含有600 μg/ml G418的10% FBS培养基更换培养基,每2天更换一次,至转染后5 d。用倒置荧光显微镜(IX71,Olympus)和图像分析系统(SPOT RFKE,USA),直接观察基因沉默的效果。
Western 印迹法检测转染细胞中的ABCE1的蛋白的表达
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
PAGE),按照《分子克隆实验指南》灌制12%不连续的SDSPAGE,分别取3组转染细胞裂解液样品(每个均取100 μg细胞蛋白)加样后电泳、电转移、封闭、第1抗体结合、第2抗体结合,ECL法显影。以βactin为内参,经凝胶分析软件分析其灰度值,结果以产物与内参照的比值表示。
检测细胞生长和增殖的情况
收集转染48 h后的3组细胞(实验组Si1,阴性对照组SiN组