文档介绍：丹酚酸B诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化
【摘要】目的:体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究中药单体丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化. 方法:用贴壁培养法分离、培养、纯化MSCs,免疫荧光法检测细胞抗原CD44和CD34. 分别用含5 μmol/L的5氮胞苷(5aza)和30 mg/L丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs 24 h后,RTPCR法检测培养1,7,14和21 ,GATA4和心肌特异性蛋白αactin mRNA的表达, 用免疫荧光法检测诱导后αactin的表达情况. 结果:获得纯化的MSCs,免疫荧光检测细胞表面标记CD44呈阳性,CD34呈阴性. 诱导后细胞形态逐渐发生变化. RT4 mRNA在MSCs有基础性的表达,而分别以5aza和丹酚酸B处理24 h后,4 mRNA表达增强,7 d时表达达高峰,以后维持在高水平,与空白对照组相比,有统计学差异(P&lt;). 未诱导的MSCs αactin mRNA表达呈阴性,丹酚酸B诱导后的第14日,出现αactin mRNA的表达. 结论:用贴壁培养法可获得纯化的MSCs,丹酚酸B可诱导MSCs向心肌样细胞分化.
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养丹酚酸B 心肌细胞
0引言
当前,细胞移植作为一项极具开创性意义的治疗方法及技术用于改善心功能及心肌活力已受到广泛关注. 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存在于骨髓基质中,由于MSCs取材方便、操作简单、增殖能力强,且具有干细胞的多向分化潜能,可被诱导成为间充质来源的多种成体细胞[1-3]等特点,被称为是组织工程最具应用前景的一种干细胞,将MSCs诱导分化为心肌细胞来修复死亡的心肌组织,具有一定的临床意义.
MSCs向心肌细胞定向分化需要一定的诱发因素. 体外研究大多学者都使用5氮胞苷(5 Azacytidine,5aza)作为诱导剂对MSCs进行诱导分化为心肌细胞. 然而作为一种白血病化疗药物,5aza会残留在细胞DNA中[4],因此诱导后的移植细胞潜在的生物安全性令人担忧. 而中药具有临床应用安全和长期有效的特点,许多中药制剂、单味中药及中药单体都具有诱导细胞分化成分. 丹酚酸B是丹参水溶性成分中最主要的活性成分,具有和一些诱导剂(如β巯基乙醇、DMSO)相似的抗氧化作用,因此开展丹酚酸B诱导MSCs分化有一定的开创性.
1材料和方法
:SD大鼠,雄性,体质量90~100 g,由广州中医药大学实验动物中心提供. 主要试剂:DMEM培养基(GBICO/BRL),胎牛血清(奥地利PAA),丹酚酸B(广州市药检所,标准品),5aza(Sigma),兔抗大鼠CD44多抗(博士德),兔抗大鼠CD34多抗(博士德),CY3标记的羊抗兔IgG(博士德),Hoechst33342 (Sigma),AllPrep RNA/Protein Kit(Qiagen),OneStep RTPCR Kit(Qiagen).

、培养无菌条件下取大鼠股骨,以含150 mL/L胎