文档介绍：骨髓间充质干细胞对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响
【摘要】目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响,并探讨其可能的机制。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化、扩增小鼠BMSCs,流式细胞术检测其细胞表面分子的表达。收集小鼠BMSCs上清液,采用MTT法检测其对小鼠S180细胞的生长抑制效应;流式细胞术检测细胞凋亡率;RTPCR检测p53、bcl2 mRNA的表达情况。结果:密度梯度离心法结合贴壁培养法能有效分离、纯化小鼠BMSCs,流式细胞术分析结果显示培养的小鼠BMSCs阳性表达CD44(%)、CD29(%),阴性表达CD34(%)。MTT法结果显示,小鼠BMSCs上清液可明显抑制S180细胞的生长,呈时间剂量依赖性;经40%、80%上清液作用48 %、%,%(均P&lt;);p53及bcl2 mRNA均表达,小鼠BMSCs上清液可上调p53 mRNA表达,下调bcl2 mRNA表达。结论:小鼠BMSCs上清液可抑制小鼠S180细胞的生长并诱导细胞凋亡,其机制可能与上调p53、下调bcl2基因表达有关。
【关键词】骨髓间充质干细胞; 肉瘤细胞; 小鼠; p53基因; bcl2基因
干细胞(stem cells,SCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞,因其可塑性而成为当今生物医学领域最前沿、最活跃的主题之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为成体干细胞的重要分子存在于多种组织,主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、脐带及外周血等。MSCs具有跨系统、跨胚层分化的潜能及来源广泛、取材方便、易分离纯化、免疫原性低、扩增力强和便于诱导等特性,已成为目前干细胞研究的热点[1
2],是干细胞疗法中的重要种子细胞。
近来,恶性肿瘤的发病率已升到疾病谱的第二位,成为严重威胁人类生命和健康的疾病。其主要特征是肿瘤细胞的恶性生长、转移及复发,其病因和发病机制尚不清楚。目前对肿瘤的治疗主要靠传统的手术、化疗、放疗三大治疗手段,虽能切除或缩小肿瘤,但却不能有效防止肿瘤的转移和复发。MSCs作为当今干细胞研究的热点,其与肿瘤关系的研究方兴未艾。一方面,有研究[36]表明MSCs可突变为肿瘤细胞,MSCs的长期临床应用可能存在致瘤的安全性问题。MSCs对肿瘤生长的影响意见不一,如Zhu等[7]把胚胎MSCs或成体骨髓MSCs和F6或SW480肿瘤细胞共同植入小鼠皮下,发现胚胎MSCs和成体骨髓MSCs均能促进肿瘤生长。虽然MSCs在突变致瘤及促进肿瘤生长和转移方面已有一些报道,但也有相反的研究结果,如Nakamura等[8]实验发现大鼠原代MSCs在体外与9L胶质瘤细胞共培养,可以抑制9L胶质瘤细胞的生长。
我们从小鼠骨髓分离、培养并鉴定MSCs,以小鼠S180肉瘤细胞为研究对象,观察MSCs对S180细胞增殖凋亡及p53、bcl2基因表达的影响,为MSCs临床应用的安全性提供更多的实验依据。
1 材料和方法
材料
实验动物
雄性健康昆明小鼠,5~6周龄,质量18~20 g,购于东南大学医学院动物实验中心。
试剂及仪器
低糖DMEM(LGDMEM)培养基、RPMI 1640培养基(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),Percoll淋巴细胞分离液(Pharmacia公司),胰蛋白酶、MTT、DMSO(Sigma公司),DMF(N,N二甲基甲酰胺,国药集团化学试剂有限公司),SDS(十二烷基硫酸钠,Serva公司),AnnexinⅤ检测试剂盒(BD公司),引物由Invitrogen公司合成,荧光标记抗小鼠抗体(CD34PE、CD29FITC、CD44PE, Pharmingen公司),RTPCR试剂盒(TaKaRa公司),流式细胞仪FACS Calibur(BD公司),酶标仪(Model550,BIORAD公司)。
细胞及培养
小鼠肉瘤细胞S180购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心,在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中呈悬浮生长,置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每3~4 d传代1次,实验选用对数生长期细胞。
方法
小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离、纯化、扩增及鉴定
小鼠BMSCs分离、纯化及扩增颈椎脱臼法处死小鼠,置于75%乙醇中浸泡5 min,无菌条件下分离出双侧股骨和胫骨,剔除脂肪、肌肉等组织,剪去干骺端,暴露