文档介绍：摘要
摘要
埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever)是一种由埃博拉病毒(Ebola virus)
引起的急性病毒性传染病,是一种致死率很高的人兽共患病。最早于 1976 年在刚
果(金)埃博拉河流域的苏丹南部和扎伊尔地区首次爆发,导致多人死亡。由于到
目前为止,此种出血热并没有十分有效的治疗药物及疫苗,且在我国境内尚无此
病症出现,因此,建立有良好特异性的检测方法显得尤为重要。本实验利用原核
表达系统成功表达出埃博拉病毒五种亚型的核蛋白,并利用埃博拉病毒扎伊尔型
核蛋白制备单克隆及多克隆抗体,为今后建立检测方法奠定基础。
目的:通过原核表达系统获得埃博拉病毒重组核蛋白。方法:将埃博拉病毒
核蛋白基因亚克隆入原核表达质粒 pET-28-(a) 中,构建重组表达载体
pET-28-(a)-EBOV-NP。重组质粒鉴定正确后,转化 BL21(DE3)感受态细菌,并
利用终浓度为 1mM/L 的 IPTG 诱导蛋白表达。蛋白成功表达后,将蛋白利用
His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化,然后通过 Western blot 鉴定表达蛋白。结果:
所构建的重组质粒双酶切产物在经过 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定之后,得到与目的
片段长度相同的特异性条带,可初步确定重组质粒构建正确。将重组质粒送样测
序后,测序结果显示与参考序列完全匹配没有突变。纯化后的蛋白经
10%SDS-PAGE 鉴定,出现与国外文献报道大小相一致的特异性条带。经 Western
blot 检测,所表达的蛋白可以与抗埃博拉病毒核蛋白多克隆抗体发生特异性反应。
结论:所获得的重组融合蛋白有很好的反应原性。
将纯化后的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白免疫日本大耳白兔及大鼠,5 次免疫
后采用心脏采血法,获得了抗埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白的多克隆抗体。用间接
ELISA 法检测所得多克隆抗体的效价为:兔血清效价 1:512000;大鼠血清效价
1:128000。经 Western blot 检测,所制多抗与埃博拉病毒核蛋白有特异性反应。
将纯化后的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白免疫 BALB/c 小鼠,首次免疫时采用
每只小鼠 50ug 蛋白加同等体积福氏完全佐剂,皮下多点注射。此后 3 次免疫采用
每只小鼠 50ug 蛋白加同等体积福氏不完全佐剂,皮下多点注射。共 4 次免疫后,
于细胞融合前三天,采用每只小鼠 50ug 蛋白不加佐剂加强免疫。3 天后细胞融合。
然后采用间接 ELISA 法筛选出阳性细胞株后,再用有限稀释法对阳性细胞株进行
3 次连续克隆后,最终获得一株抗扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白的特异性杂交瘤细
I
摘要
胞。其细胞培养上清的 ELISA 效价为 1:×104,所制备得到的小鼠腹水的效
价为 1:×106。这一株特异性单克隆抗体的成功制备为今后检测方法的建立打
下了良好的基础。
关键词:原核表达系统;埃博拉病毒;多克隆抗体;单克隆抗体
II
Abstract
Abstract
Ebola hemorrhagic fever is an acute viral disease, which is caused by Ebola virus.
Ebola hemorrhagic fever firstly broke out in Congo(golden) Ebola river basin of
southern Sudan and Zaire area in 1976,and resulted in many hemorrhagic
fever is a zoonoses with high lethality rate,because there aren’t effective specific
medicines and ines for this hemorrhagic ,it doesn’t appears in our
country up to now,but it is particularly important to establish a quickly and specific
detection experiment essfully expressed five s