文档介绍：提高HCV的检测质量
    作者:于小洋
      自从1989年正式确认丙型肝炎病毒(HCV)以来已经过去16年,对丙肝的研究已经取得比较大的成就,但是丙型肝炎对人类健康的威胁仍在日益显现。据WHO统计,全球HCV的平均感染率为3%,,。%,%,%~%,感染人数估计有3700万。受感染的母亲传播给婴儿的发生率约为5%。患急性丙型肝炎后约有55%~85%的患者可变成慢性丙型肝炎,其中5%~20%的人20~25 年后可发展为肝硬化,肝硬化患者10年内30%发展为终末期肝病[1-2]。
与检测乙型肝炎病毒(HBV)相比,HCV的检测还有许多难题待解决。目前存在的主要问题有:由于HCV抗原结构的特殊性,直接检测血清中HCV抗原的技术还没有彻底解决;抗体(抗-HCV)出现时间晚,从HCV感染后到抗体转阳的时间平均为50~70天,有的患者可延长至6~9 月,因此这一时期又被称为容易漏检的“窗口期”;病毒基因型复杂而且容易变异,使基因水平的检测质量不够稳定。
鉴于上述原因,提高丙型肝炎病毒检测质量一直是医学检验领域中的重要课题。随着近年来有关人员的不;断努力和相关科学的发展,已经在HCV的检测质量方面有了重要进展。
1  关于第三代抗-HCV试剂的应用
检测丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)仍是目前常用的手段,这方面的检测方法主要是第三代酶免疫测定法(EIA)或间接酶联免疫法(ELISA),我国大多采用ELISA方法。
第三代ELISA试剂比第一、二代试剂有明显的改进,其基本原理是以HCV抗原包被酶标板,用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与被检血清中的抗-HCV反应,邻苯二胺(OPD)或3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色后,根据颜色的深浅进行阴阳性判断。该方法中包被抗原的组成和质量是关键因素。与之相比,第一代抗-HCV ELISA采用的抗原C100-3是HCV非结构基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶(SOD)基因嵌合后表达的融合蛋白,由于C100只含363个氨基酸,而HCV基因组编码的蛋白有长达3010个氨基酸,因此C100-3抗原-抗体系统只代表整个HCV抗原-抗体系统的一小部分,所以敏感性不高;抗C100-3出现也太晚,不适于早期诊断。第二代抗-HCV ELISA在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c,使检出率提高25%~30%,而且检测抗体的窗口期有所缩短,但由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽,所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题和少数漏检问题。当前用的第三代抗-HCV ELISA试剂,其包被抗原为HCV核心抗原,NS3、NS4和NS5抗原,使特异性达到99%[3]。
虽然第三代HCV抗体ELISA试剂增加了HCV NS5区表达的蛋白作为抗原,提高了试剂敏感性,但是从HCV感染到可检测出抗体(窗口期)通常还需平均40多天,因此,第三代ELISA试剂的质量仍需提高和改进。例如在筛查实验的特异性方面,丙肝抗体酶联免疫检测试剂的特异性并不如想象中的高,并经常出现假阳性结果。对强阳性或弱阳性样本检测,国产试剂(主要厂家)的S/CO值高于进口试剂,但是无论对阳性及阴性样本检测,国产试剂(主要厂家)的CV值及特异性均明显低于进口试剂,以致出现更多的假阳性结果。此外,丙肝抗体酶免检测试剂皆没有灰区的设定,S/CO比值较低(但大于1)的结果也报告阳性,亦是假阳性比较多存在的原因[4]。
为弥补这些问题,一些实验室在使用补充实验。国外使用重组免疫印迹试验(binant immunoblot assay,RIBA),其抗原包括:C22-3、C33c、C100-3和克隆5-1-1共4种。RIBA是抗-HCV试剂的补充试验,使抗-HCV的结果更准确。在献血人群的筛查中,由于抗-HCV的阳性预测值远低于实际情况,所以免疫印迹检测可应用于献血人群的筛查。在美国和欧盟,曾一度出现以HCV RNA检测替代免疫印迹试验的趋势,但因其成本-效益问题,所以,美国疾病控制中心(CDC)又重新提出免疫印迹检测的应用。我国HCV抗体检验实验室亦应尽快执行国家CDC推荐的HCV实验室检验方法,达到既减少HCV抗体检验结果报告的假阳性数,又使检验结果的可信度提高[5-6]。相信在此方面会有不断的发展。
2  关于丙型肝炎病毒RNA的检测
虽然HCV感染后到出现抗体有一个较长的窗口期,平均为50~70天,但HCV基因组的复制出现却很早,感染后数天即出现病毒血症。因此直接检测HCV RNA对于早期诊断HCV是重要的。
目前用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清中的HCV RNA,包括定性和定量两种方法