文档介绍：零下非结冰保存人工肝用永生化肝细胞课题来源:全军医学科研“十一五”计划专项项目国家“’
零下非结冰保存人工肝用永生化肝细胞博士研究生:李庆勇指导教师:张清华教授摘要肝功能衰竭是多种因素引起的严重肝功能损害,现有的病因治疗及一般支持治疗疗效甚微,病死率高达%。目前肝移植被认为是急慢性肝功能衰竭晚期最有效的治疗方法,但是肝移植存在供体严重不足、手术复杂风险大、患者需要终身免疫抑制治疗及费用昂贵等缺点,导致众多患者在等待供肝期间死亡。而生物人工肝支持系统姆⒄刮8喂δ衰竭的治疗开辟了新的途径:一方面部分患者急性肝功能衰竭是可逆的,通过唐谟行У母喂δ苤С郑颊吒卧嗫赏ü写娴恼8蜗赴ピ錾而恢复功能;另一方面对于不可逆的急慢性肝功能衰竭患者,也可以通过的体外肝功能支持,为最终的肝移植赢得宝贵的待肝时间,:①质量G螅焊蜗赴弑柑迥诟蜗赴宄舅亍⑸镒;昂铣伞分泌等主要功能。②数量要求:肝细胞数量至少达到鍪考叮能达到牧俅仓С忠G蟆"劭焖倭俅灿τ要求:临床上各种原因引起的肝功能衰竭患者,往往病情危重,必须短时间内获得大量的肝细胞用于逋飧喂δ苤С种瘟啤R虼嘶竦么罅抗δ芎玫母蜗赴荁的核心,是制约俅补惴河τ玫钠烤薄K蕴剿鞒鲆恢质涤每煽康牡臀保存体系,建立一个随时可用的肝细胞库,是际跗毡橥广的基础。温度是影响低温保存效果的关键因素:一般而言温度越低,细胞的代谢活博士学位论文
性就越低,保存时间就越长。零下非结冰温度是指娴侥橙芤罕阒涞奈露确段В环矫婵梢允勾唤抵磷畹停不同于常规低温保存℃及,另一方面可以避免“冰晶形成’’、“渗透性休克’’等深低温冻存损伤,理论上且恢掷硐氲南赴4嫘问健最早用于供肝的保存,使供肝的保存时间明显延长,但供肝的保存混杂有缺血再灌注损伤的影响,不能完全反应对肝细胞的保存效果。目前杂郎蜗赴的保存效果仍然不明确。因此,本文将在第一部分用液一℃4郎蜗赴9娴臀婕℃冉希悦魅稴保存肝细胞的效果。酶蜗赴丛粗两裆形吹玫铰饨饩觥是一种人源性永生化肿瘤细胞,具有良好的增殖活性及肝细胞特异功能,如分泌蛩睾铣捎糖原合成等。蜗赴枪谑褂谜H烁蜗赴秆〕龅囊恢钟郎蜗赴株,具备氨基清除及分泌白蛋白等功能,增殖迅速且传代稳定。有关隠肝细胞4婧笊镅匦员浠捌洳钜焐胁幻魅贰R虼耍狙芯拷诘二部分用液.℃4鍯与蜗赴员冉系臀卤4婧驝与赴纳镅匦员浠捌銪应用倾向性。液壳氨蝗衔J枪└伪4娴谋曜家海随着生物人工肝的发展,对肝细胞的需求明显增加,液也被用于肝细胞的短期低温保存且效果明显,但液费用昂贵,很多成份难以获得。费用较便宜的虷液也被用于供肝保存的研究,以期待获得同液相同的效果。但液、。因此,本文将在第三部分分别采用液、汉虷液零下非结冰保存生物人工肝用赴,以比较其保存效果有无差别并探讨其中可能的机制。研究发现细胞凋亡是除了坏死之外肝细胞冻存死亡的一个重要的途径,但低温保存引起细胞凋亡的具体机制仍然不清楚。/鞍准易迨俏挥谙吡体膜上通过调节线粒体非渗透性转换孔的开放及细胞色素氖头乓种苹蛘叽中文摘要
ü煌揪兑种频蛲龅姆⑸珺则促进凋亡的发生虼薆/戎凳呛饬肯赴蛲鲋甘囊桓鲋匾V副辍D壳坝泄.℃。因此本文将在第四部分分别采用.℃。。4鍸一细胞,以明确/基因和蛋白表达同低温保存引起细胞凋亡的关系,探索低温保存引起细胞凋亡的可能机制。体外培养永生化赴票赋上赴海琔毫阆路墙岜一及常规低温℃及分别保存及蕴剿髁阆路墙岜4娓蜗胞的效果以及同细胞凋亡的关系。⑾赴嘌跋赴褐票福捍右旱V腥〕龆炒娴腖细胞,迅速投入℃水浴箱中,待其完全溶解后转入超净台内进行操作。①严格按照无菌操作方法进行,接种到培养瓶。所用基础培养基为/碧砑痬鹊核疞,青霉素/疵顾//奶ヅ血清"诮嘌恐糜,/,ナ6鹊呐嘌淠谂嘌③倒置显微镜观察%以上细胞贴壁后换液危院竺换液危敝内壁长满。④取内壁长满的一瓶细胞,吸除培养液,加ヒ让竘,于室温消化,同时观察细胞形态,一旦发现胞质回缩细胞间隙增大,即刻吸除胰酶,终止消化。⑤加的/培养液,用吸管反复吹打内壁,使细胞完全脱离瓶壁。⑥将同批多瓶赴夯旌希∫坏沃裂细胞计数板,计算细胞细胞密度,最终将细胞浓度调至个/肿爸冻存管。⑾赴臀卤4妗⒎肿榧案次路绞剑孩俜肿暗冻存管,痬,离心,,混匀。博士学位论文/
结果分别至一、℃低温保存,℃组愣确墙岜及对照组孔霰瓯尽"诘臀卤4、后,