文档介绍：第五节微生物的诱变育种
一、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞,促进其突变率显著提高,然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
2个主要环节:
诱变(随机)
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞,以引起绝大多数细胞致死的同时,使存活个体中的突变频率大大提高。
筛选(定向)
设计有效的筛选方法,将少量正变株中的优良菌株挑选出来。
(一) 出发菌株(original strain)
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。
具有有利性状(如高产、生长速度快、营养要求粗放、
标记明显等);
对诱变剂敏感
野生型菌株;
从生产中选育的自发突变菌株;
诱变获得的高产菌株
出发菌株的选择标准:
出发菌株的来源:
(二) 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液(均匀、分散)
目的:①使每个细胞能均匀接触诱变剂;
②减少表型延迟现象(诱变后性状的分离及退化现象)
2. 同步培养(生理状态一致)
3. 菌龄:对诱变剂最敏感时期营养细胞:对数期
孢子或芽孢:萌发前期
:生理盐水配制
化学诱变:缓冲液配制
5. 菌悬液的浓度酵母菌,霉菌的孢子:106个/mL
细菌,放线菌孢子:108个/mL
(三)诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择(高效,简便)
物理诱变剂:频度低、大损伤,难修复,且操作简便;
化学诱变剂:频度高,点突变,易回复突变,操作麻烦。
( NTG——超诱变剂)
UV是最常用的一种诱变剂
2. 剂量的选择
突变率随剂量的增加而提高,但到达一定程度后,再提高剂量, 反而会使突变率下降。
正变较多出现在偏低剂量中,而负变较多出现在偏高剂量中。
在产量变异工作中,常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至30~70%的剂量。
UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。
最适剂量:在提高突变率的基础上,既能扩大变异幅度,
又能使变异向正突变范围移动的剂量。
常以杀菌率来表示相对剂量(剂量-存活率曲线)
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理:
①同一诱变剂的重复使用;
②两种或多种诱变剂的先后使用;
③两种或多种诱变剂的同时使用.
(四) 中间培养(CM,培养过夜)
目的:克服表型延迟
表型延迟(phenotypic lag):表型的改变落后于基因型改变的
现象.
分离性延迟: 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯
合状态,表型才能表现出来。
生理性延迟: 由杂合状态变为纯合状态,突变表型仍不能
表现出来。
分离性延迟的原因: 对数生长期中,单核细胞常出现双核现象,多核细胞的核也成倍增加,诱变对数期的细胞时,突变通常发生在一个核上,故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离,这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。
生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。
生理性延迟:
(五)突变株的筛选
初筛
复筛
1. 初筛(以量为主)
(1)利用形态变异:需预先测定形态与产量的相关性
(2)根据平板颜色反应直接挑选
透明圈法(蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶);
抑菌圈法(抗生素);
变色圈法(柠檬酸)、显色圈(氨基酸);
沉淀圈法(外毒素)
透明圈直径(H)/菌落直径(C):产量高低(初筛指标)
2. 复筛(以质为主,定量测定)
摇瓶培养,直接检测所需产物
方法需简便、快速
2步
诱变育种的基本原则:
选择简便有效的诱变剂;
挑选优良的出发菌株;
处理单细胞或单孢子悬液;
选用最适的诱变剂量;
充分利用复合处理的协同效应;
利用和创造形态、生理与产量间的相关指标;
设计高效筛选方案;
创造新型筛选方法。