文档介绍：原  理
蛋白质分子在溶液中由于其末端氨基、末端羧基及侧链的游离基团而成为带电颗粒,并可在电场内移动,其移动方向取决于蛋白质分子所带静电荷。不同蛋白质分子根据其氨基酸组成及所在溶液的pH值,携带的静电荷不尽相同,致使它们在电场中的迁移率各异,从而达到分理的目的。
电泳原理示意图
在蛋白质组学中对电泳的分类
一维电泳(one dimensional gel electrophoresis, 1DE),现在普遍采用垂直板聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE)
二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE),又称双向电泳
一维电泳
现在普遍采用聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE),包括非变性电泳(native PAGE)和SDS-PAGE两种,前者主要是在分离蛋白复合物时经常用到。后者是在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS),蛋白质分子被大量SDS阴离子包裹,消除了它们间原来携带的电荷差别,因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小,故广泛用于蛋白质分子量的测定。
凝胶浓度和蛋白质分离范围
缓冲液的选择
通常在SDS-PAGE均选择Tris-glycine作为电泳的缓冲系统。但在大部分缓冲系统中,SDS微团(micelle)会干扰小分子蛋白质的分离,而Tris-tricine系统则可使小蛋白质-SDS复合物与微团分离,去除干扰。此外,也证明该系统对脂多糖和脂寡糖混合物的分离有效。
12%胶常用的低分子量标准蛋白
名称
来源
分子量
磷酸化酶B
兔肌肉
97400
牛血清白蛋白
牛
66200
卵清蛋白
鸡蛋清
45000
碳酸酐酶
牛
31000
胰蛋白酶抑制剂
大豆
21500
溶菌酶
鸡蛋清
14400
一维凝胶染色
现在用于凝胶中蛋白染色的方法包括氨基黑10、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝R350、银染、铜染及橙染(sypro orange)。最常用的为考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝R350染色,为了提高灵明度采用银染。
一维电泳的应用
初步测定蛋白质的分子量
初步分离蛋白质复合物,并进一步用于免疫组化分析
对重组表达蛋白的初步鉴定
将一维电泳和生物质谱相结合,达到对较简单蛋白复合物的分离和鉴定
一维电泳在蛋白质组研究中的应用举例
我们将一维电泳和LC-Ms/MS结合,成功进行如下研究:
   (1)血浆蛋白质组研究
   (2)SARS病毒蛋白的分析鉴定,成功鉴定了SARS病毒的S蛋白、N蛋白和E蛋白,有力推动了我国第一个SARS疫苗的研究和申报工作。
双向电泳(2DE)
原理:2DE就是第一向采用等电聚焦分离,第二向为SDS-PAGE分离。由于 2DE是依据蛋白质的两种不同性质,即等电点和分子量进行分析,因此分辨率远高于其他任何一种单一的电泳方法,是目前分析混合蛋白质样品最有效的手段。(注意:双向电泳中的“双向”指的是按照蛋白质的两个性质即“等电点和分子量”进行分离的原理。)
2DE仪器系统
2DE在蛋白质组学方案中所处的位置
这就是将2DE和质谱相结合进行比较蛋白质组分析的实验方案。(方案完后),下面,我将汇报用以上介绍的方法进行脾淋巴细胞及乳腺癌比较蛋白质组学的实验结果。
双向电泳的操作程序(以进行差别表达蛋白组分析为例)
1. 样品制备
2. IPG strips重泡胀及上样(rehydration and liading)
3. 等电聚焦
4. 胶条平衡,包括还原和烷基化
5. 第一向胶条转移到第二向
6. SDS-PAGE
7. 染色
8. 图像分析
目前,普遍采用预制的固定pH梯度胶条(immobilized pH gradient strips, IPG strips)。商品化的IPG strips可以从Amersham Pharmacia公司或BioRad公司购买。
IPG胶条制备(casting of IPG strips)
IPG slab gels with linear gradients pH 4-7, 4-9, 6-10 and 4-12 are cast according to Görg et al. (1986) with the recipes of Righetti (1990) and Görg et al. (1998).
Two starter solutions (an acidic one and a basic one) are prepared as described in Table 1. For better polymerization, the acidic and basic solution