文档介绍：新开发的T7驱动表达技术以pETBlueTM系统为代表。pETBlue载体包括了pET用于表达的优点,在目标基因克隆和质粒DNA操作的方面更为方便。pETBlueTM系统:新一代T7表达载体 pETBlue载体代表了新型表达载体,它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌tet启动子的反义方向插到lacZa-肽编码区,因此可进行蓝/白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的T7转录和翻译信号使表达成为可能。与标准pET载体一样,通过转化λDE3溶原菌并用IPTG诱导或通过lCE6感染原始宿主菌生产目标蛋白。优点·蓝/白斑筛选,便于克隆·高拷贝数,质粒DNA高产·epTorTM载体或perfectlyBlunta载体形式提供,便于快速PCR克隆·目标基因无基础水平表达,消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性·表达水平与经典pET载体相同·用TunerTM(DE3)pLacI宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。PET系统:大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌 pET载体中,目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下,并通过在宿主细胞提供T7RNA聚合酶来诱导表达。Novagen的pET系统不断扩大,提供了用于表达的新技术和选择,目前共包括36种载体类型、15种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。优点·是原核蛋白表达引用最多的系统·在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低·真正的调节表达水平的“变阻器”控制·提供各种不同融合标签和表达系统配置·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC载体试剂盒提供,用于迅速定向克隆PCR产物·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化阳性pFORCETM克隆系统具有高效克隆PCR产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。pETBlueTM系统T7驱动的严紧控制表达、蓝/白斑筛选、质粒产量高新颖的pETBlueTM系统兼有广受欢迎的蓝/白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数,以及pET载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝/白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子(tet)驱动lacZa-肽表达而实现,而目标基因表达由相反方向的T7启动子驱动。目标序列插入多克隆位点(MCS)破坏了lacZa-肽的表达,在NovaBlue菌株中当存在x-gal时产生白菌落表型,而带有非重组载体的菌落变蓝。由于T7驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于tet启动子的反义方向,因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于pET载体,pETBlue质粒上高拷贝PUC复制起点增加了质粒产量,为测序、突变和其它质粒操作带来方便。如果插入序列相对于T7lac启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求,pETBlue载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达:用lCE6(lpL启动子控制T7RNA聚合酶表达的噬菌体)感染,或转化重组pETBlue质粒到宿主菌TunerTM(DE3)pLacI或OrigamiTM(DE3)pLacI中并用IPTG诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因,并通过相容的pLacI质粒提供足够lac阻遏蛋白,以确保低水平的未诱导表达。Tuner菌株的