文档介绍：实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学****琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术,检测上次实验课提取的质粒DNA
二、实验原理
带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法
泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下,单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比,与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率,在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率
影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度
DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质:琼脂糖凝胶和聚丙烯酰***凝胶
关于电泳
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应
在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型
琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子
可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子,常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系
质粒DNA分子有三种构型:
CC DNA(共价闭合环状DNA:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构,DNA呈现超螺旋)、
OC DNA(开环DNA: 质粒的一条链断裂)
L DNA (线形DNA: 质粒的两条链均断裂),
\ 这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同, DNA泳动最快,其次是LDNA,最慢的是OCDNA
CC DNA
LDNA
OCDNA
电泳方向
EB:即溴化乙锭,它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入,在紫外光的照射下,凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光,易于检测。可以检测10ng 的DNA
注意:EB是一种诱变剂,操作时一定要注意安全,必须戴塑料或乳胶手套
GoldView™:是一种可代替EB的新型核酸染料,采用琼脂糖电泳检测DNA时,GoldView™与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光,而且也可用于染RNA。
DNA的染料
线性DN***段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系
琼脂糖凝胶的百分浓度
分离线性DN***段分离的有效范围(kb)
60 ~5
20 ~1
10 ~
7 ~
6 ~
4 ~
3 ~
聚丙烯酰***凝胶电泳
聚丙烯酰***凝胶电泳是一种人工合成的凝胶,由丙烯酰***单体和交联剂甲叉丙烯酰***在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成
可以分离小片段(5~500bp)DNA分子
聚丙烯酰***凝胶电泳的应用:
蛋白质分子的分离鉴定
蛋白质分子量的测定
核酸的分析
核酸序列测定
-,核酸分***基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
实验原理
三、仪器、材料与试剂
微波炉
琼脂糖凝胶电泳系统
紫外线透射仪
质粒DNA
DNA marker
50×TAE
6×凝胶加样缓冲液
琼脂糖
1%溴化乙锭溶液
溶解琼脂糖
分离质粒DN***段
检测质粒DN***段
电泳样品
DNA相对分子质量标准物
电泳缓冲液
沉降DNA并起指示作用
电泳支持介质
嵌入DNA中,在紫外灯下显色