文档介绍：实验六 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白质
指导教师
刘建昌、池雪林
一、目的
1、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原理、操作方法。
2、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。
二、原理
“不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率,这种电泳的主要特点是:(1)使用两种不同浓度的凝胶系统;(2)配制两种凝胶的缓冲溶液成分及PH值不同;(3)配胶缓冲液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、PH值也不相同。在实验中,电泳凝胶分为两层:上层胶为低浓度的大孔胶,称为浓缩胶,成胶的缓冲液是Tris-HCL,;下层胶则是高浓度的小孔胶,称为分离胶,成胶的缓冲液是Tris-HCL,。电极缓冲液则是Tris-甘氨酸,。可见,凝胶浓度、成胶成分、PH值与电泳缓冲液系统各不相同,形成了一个不连续系统。
在不连续系统中电泳时,甘氨酸、蛋白质、盐酸中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子,形成离子流向阳极泳动。当电极缓冲液()中的甘氨酸离子进入浓缩胶时,pH值降到接近于甘氨酸等电点(),于是甘氨酸的解离度突然降低,所带电荷明显减少,迁移率减慢。样品中蛋白质成分也进入浓缩胶,pH值的改变虽对其解离度有影响,但比对甘氨酸小得多,其迁移率比甘氨酸要大,而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。浓缩胶中的Tris-HCl中Cl离子则全部解离,其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子的迁移率形成:甘氨酸〈蛋白质〈溴酚蓝〈Cl离子的顺序。
甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降,造成移动离子流的突然缺失,出现电流减少电导率下降,然而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变,根据电导及电位梯度成反比,于是在前导离子Cl与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质各成分,在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前导Cl离子区域。当到达前导Cl离子区域时因不缺少离子,大的电场强度减弱,离子移动速度急速减慢下来,结果在甘氨酸和Cl离子之间的蛋白质样品就按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩了好几百倍,且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。
当离子流继续向前,,蛋白质分子在小孔胶里遇到阻力,迁移率减慢,,甘氨酸又充分解离,其带电量增加,消除了离子流缺失的现象,小分子的甘氨酸离子赶上了蛋白质。凝胶各部分恢复具有恒定的电场强度,蛋白质的分离完全按一般区带电泳方式进行。
不连续电泳最主要的优点就是使蛋白质样品经浓缩胶后,形成紧密地压缩层进入分离胶。蛋白质各成分预先分开且压缩成层,可以减少在电泳时由于自由扩散而造成的区带相互重叠,这样就是提高了电泳的分辨能力。
三、试剂及器材
(1)制备两种胶的贮存液:见操作。
(2),加蒸馏水到1000ml,。用前稀释10倍。
(3)染色液:,加入454ml甲醇水溶液和46ml冰醋酸。
(4)脱色液:75ml冰醋酸、875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。
(5)凝胶电泳玻管:选内径5~6mm、外径7~8mm、长80~100mm光滑均匀的玻璃管。
(6)5~10ml注射器
(7)10cm长注射器针头(7号)
(8)100μl微量取样器。
(9)圆盘电泳槽
(10)%溴酚蓝
四、操作
1、凝胶柱的制备
将洗净烘干的玻璃管一端插入疫苗瓶的橡皮帽中,或用其他材料将玻璃管一端封闭。将封闭的一端朝底垂直放于桌面支架上。
按表6-1先配制分离胶,在50ml干燥小烧杯中按比例加入1、2号溶液及蒸馏水,放入干燥器中,用水泵或抽气机抽气至溶液中无气泡冒出为止。取出,加入新配制的过硫酸铵,用玻璃棒混匀,。然后立即顺管壁加入5~10mm高的水层,以隔离空气加速凝胶的过程。待30min既凝聚成胶,此时胶与水之间形成一条明显的界线。倒出胶面上的水,也可用滤纸条吸干。
100ml溶液中的含量
溶液混合比例
1号
1mol/L HCl
Tris
TEMED
分离胶
1号 1份
2号 2份
H2O 1份
(抽气)
3号 4份
%,
2号
Acr
Bis
3号
过硫酸铵
100ml溶液中的含量
溶液混合比例
4号
1mol/L HCl
Tris
TEMED
分离胶
4号 1份
5号 2份
7号 4份
(抽气)
6号 1份
%,
5