文档介绍：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳
一、实验简介
1、实验目的
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验,初步掌握聚焦电泳的基本原理和实验技术
2、基本原理

。若在某特定的pH环境中其净电荷为零,此时的pH为该蛋白质的等电点。在电场下不泳动。

在常规电泳中,通常只是在恒定的缓冲液中进行分离,假定有A, B两个蛋白质组分,分别带有净电荷-3和+1。在一个pH9的缓冲洗脱中,带负电荷的蛋白质均放在靠阴极一侧电泳,此时带负电荷多的A蛋白质受阳极影响大,泳动速度比B快,最终会超过B,这样二者就会得到分离。
在等电聚焦电泳中,分离是在连续的pH梯度中进行的。如果把A,-10的pH梯度中的pH6的位置,则A蛋白质的净电荷为-2,减少两个净电荷;B蛋白质的净电荷为+2,多了两个净电荷。在相同的电场下,A移向阳极,B移向阴极,当它们达到净电荷为零时停止迁移,这种行为称为聚焦反应。
蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点,这是一个”稳态”过程,一旦达到等电点的位置,蛋白质就会停止迁移。达到稳态后,如果它要正极或负极任何一侧扩散,均会受到相应的pH制约,即若向负极扩散带负电,会受到阳极的影响,迫使其扩散后退回原位;若向正极扩散带正负电,会受到阴极的影响,迫使其扩散后退回原位。因此,蛋白质能在等电点位置被聚焦成一条稳定的窄带。

(1) Ampholine(瑞典LKB)
它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的, -,4-,5-8,-.
(2) Servalyte(德国Serva公司)
它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的. pH范围:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.
(3) Pharmalyte (瑞典Pharmacia)
七氨基多羧基组成的
pH范围: -5, 4-, 5-8, 8-10, 3-10 等
(4)载体两性电解质(军事医学科学院)
合成的方式与Ampholine基本相同. pH范围: 3-, -, -, -, -, -
3 pH梯度的形成

在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,)。所以载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零. 引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移.